氯化两面针碱对乳腺癌抑制作用及与阿霉素协同作用的研究

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目的乳腺癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一,在我国它也是临床中的常见病、多发病。围绕其治疗,临床上提出了多种研究方向,其中药用植物提取物的应用为重要的研究策略之一,且其成果目前已广泛应用于临床。两面针碱来源广泛,可自芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取。氯化两面针碱(Nitidine chloride)是两面针碱经氯化作用形成的一种特殊类型的生物碱,有实验研究表明其具有抗真菌,抗炎,抗氧化的功能,更有研究提示其有抗艾滋病的潜在功能。同时早期研究发现,氯化两面针碱能够抑制肝癌细胞、骨肉瘤细胞和胃癌细胞的增殖,还能够通过抑制c-Src/focal adhesionkinase (FAK)有关的信号通路抑制乳腺癌的转移。我们建立乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231两种模型,探讨氯化两面针碱及联合化疗药物阿霉素后对以上两种乳腺癌细胞株细胞毒性的影响。方法我们通过细胞活力试验(MTT assay)检测细胞活力。克隆形成试验(Colony formation assay)检测单个细胞增殖能力。流式细胞分析仪检测细胞周期(Cell cycle analysis),分析氯化两面针碱对乳腺癌细胞周期分布之影响。TUNEL试验(Terminal deoxynucleotidyl transferased UTP nick endlabeling assays)和凋亡检测试验(Flow cytometric apoptosis assays)检测氯化两面针碱诱导的乳腺癌细胞凋亡作用的影响。线粒体膜电位分析(Measurement of the mitochondrial membrane potential assays)检测氯化两面针碱诱导细胞凋亡的途径。蛋白免疫印迹试验(Weston blot)检测使用氯化两面针碱后对乳腺癌经典P53和AKT通路,及对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响。通过计算两种药物的联合抑制率(CDI),分析验证氯化两面针碱与阿霉素在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中的协同促进细胞毒性的作用。结果我们通过细胞活力检测试验(MTT assay)发现氯化两面针碱可以抑制乳腺癌细胞的增殖(P<0.05)。流式细胞凋亡检测试验(Flow cytometric apoptosis assay)表明氯化两面针碱可明显诱导乳腺癌细胞的早期凋亡,同时发现其可以引起G2/M期细胞周期阻滞(P<0.05)。结合Annexin V/PI双染色、TUNEL染色分析和JC-1线粒体膜电位分析的实验结果,证实氯化两面针碱可诱导乳腺癌细胞的凋亡,并发现是通过细胞线粒体膜电位途径发挥作用,同时具有时间和剂量依赖性(P<0.05)。在分子机制方面,我们发现癌细胞增殖的抑制作用同p53和p21蛋白的增加相关联,并且具有时间和浓度依赖性。通过蛋白免疫印迹方法(western blot analysis),发现氯化两面针碱在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中可以上调促进凋亡的蛋白Bax, cleavage-caspase-3,9和cleavage-PARP的表达,并且下调抗凋亡的蛋白Bcl-2, caspase-3和PARP的表达。应用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002,我们发现抑制AKT的表达可以促进氯化两面针碱对乳腺癌细胞活力的影响,同时增强氯化两面针碱对乳腺癌细胞凋亡的诱导,进一步的证实氯化两面针碱可以通过抑制磷酸化的AKT而起到抑制乳腺癌细胞增殖同时诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。最后通过MTT试验检测细胞活性,统计分析证实阿霉素和氯化两面针碱联合应用具有协同抑制乳腺癌细胞增殖的作用。结论我们研究表明氯化两面针碱在雌激素受体阳性和雌激素受体阴性的乳腺癌细胞中,均具有抗癌的作用。这种抗癌的作用是通过介导G2/M期细胞周期阻滞,并可诱导细胞早期凋亡。氯化两面针碱诱导细胞凋亡是通过上调促进凋亡蛋白的表达,同时下调抑制凋亡蛋白的表达而发挥作用。最重要的是,研究发现氯化两面针碱与阿霉素联合应用可以增强阿霉素对乳腺癌细胞的毒性作用同时能减少阿霉素的使用剂量,从而证实了氯化两面针碱在乳腺癌的治疗中具有潜在临床应用价值。
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