背景:乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,占女性新发癌症病例的30%,据统计2020年约有226万新增乳腺癌患者被确诊,是女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌的形成在外部因素的影响下改变了细胞癌基因的结构或调控,导致细胞生长和分化失控,并发生恶性转化。另一方面,肿瘤微环境也会影响乳腺癌的进展。由于转移是大多数情况下肿瘤复发的原因,具有远处转移的乳腺癌症患者预后较差,五年生存率低于30%。因此,深入了解乳腺癌症转移中发生和发展的潜在机制具有显著的临床意义。锌常常会以锌指蛋白的形式参与体内基因表达,维持蛋白质和核酸的结构,细胞内分子运输和免疫等的任务。因为最初发现的锌指蛋白长得像手指,很多人认为像手指一样的蛋白才应该叫锌指蛋白,但现在这个定义早已被不断发现的同类蛋白质给扩大化了。锌指蛋白一般指的是所有需要结合锌才能正常行使功能的一类蛋白质。锌指蛋白没有固定的结构和作用,他们一般在调控基因表达,稳定结构方面发挥作用。锌指蛋白746（Zinc finger protein 746,ZNF746）最初被鉴定为E3泛素连接酶Parkin的底物,与帕金森病相关。越来越多的证据表明,ZNF746的异常表达与癌症进展有关。ZNF746可以通过增加c-Myc的稳定性来促进结直肠癌的进展。下调ZNF746可抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭和上皮间质转化。褪黑素通过下调ZNF746抑制膀胱肿瘤发生。根据上述实验结果,推测ZNF746作为肿瘤促进基因可以通过影响转录因子和肿瘤细胞来促进癌症进展。然而,尚不清楚ZNF746是否在乳腺癌中起作用。Notch信号通路已在细胞增殖和分化中明确定义。Notch信号通路的关键特征之一就是细胞外信号和转录输出之间的直接联系,而不需要像许多其他信号通路那样需要延伸的蛋白质链介导。在许多生物过程中,包括癌症发病和进展期间的形态变化,Notch介导的基因表达活性与细胞形态调控之间存在密切相关性。Notch信号通路通过接触附近细胞之间的短距离信号控制细胞增殖、命运、分化和细胞死亡。成纤维细胞是间质肿瘤生长的重要组成部分,也被证明受到Notch调节的影响。近年来,越来越多的研究表明Notch信号通路的异常激活与肿瘤发生有关,其中包括乳腺癌。Notch信号在肿瘤中通过IL-6/STAT3通路中不同部门之间的关系调节。数据支持Notch信号控制的最初医学证据是通过IL-6,在IL-6中乳腺癌细胞诱导Jagged1自分泌。Notch通过肿瘤启动细胞的维持、肿瘤细胞命运的指定、增殖、存活和运动促进乳腺癌症的进展。此外,Notch被认为是调节肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中各种旁分泌和旁分泌通讯的决定性机制。Notch信号通路被邻近细胞中配体和受体之间的相互作用激活。Notch表达受缺氧和炎症细胞因子（IL-1、IL6等）调节,并由配体结合激活。它包含四个Notch受体,分别为Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4;以及五个相关配体,Jagged-1、Jagged-2和Dll-1（Delta-like-1）、Dll-3（Delta-like-3）和Dll-4（Delta-like-4）;这些蛋白质分子都是膜结合的,传导旁分泌信号,存在于动脉而非静脉血管。Jagged1是Notch信号通路中的主要配体之一,当Jagged1与Notch受体结合时,Notch胞内结构域（Notch intracellular domain,NICD）将在细胞质中释放并转移至细胞核,然后转录激活下游靶基因,如HES1。已有研究发现Jagged1的变异与肿瘤的发生发展有关。同时,Notch信号通路在决定巨噬细胞的细胞命运中也起着重要作用,尤其在分化成为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）中至关重要。TAM是乳腺肿瘤炎性浸润的重要组成部分。TAM在不同刺激下起到的作用不同,可能起到预防肿瘤,亦或是促进肿瘤的作用,这取决于巨噬细胞的极化状态。巨噬细胞在肿瘤中主要分化为M1样和M2样表型。M1样巨噬细胞代表典型活化的巨噬细胞,M2样巨噬细胞代表交替活化的巨噬细胞。M2样巨噬细胞的TAM与肿瘤的生长和转移密切相关。巨噬细胞表现出与Notch信号通路相关的转录组信号。Jagged1/Notch信号通路的激活影响巨噬细胞的分化和极化。已有研究表明GATA1通过Jagged1/Notch信号通路促进卵巢癌的增殖和转移,HOXA-AS2通过激活Notch途径加速宫颈癌细胞增殖和迁移能力,PKMYT1通过激活Notch信号通路增强非小细胞肺癌的细胞增殖和肿瘤形成。在本研究中,我们研究了ZNF746过表达或沉默对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及来自ZNF746过度表达或沉默的肿瘤细胞的条件培养基对M2巨噬细胞极化的影响。此外,我们探讨了Jagged1/Notch信号在ZNF746介导的乳腺癌细胞中的作用。研究方法:使用UALCAN在线数据库评估ZNF746的表达（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）,利用生物信息学分析ZNF746表达与乳腺癌患者总生存期的关系。收集40对乳腺癌组织和癌旁组织,通过蛋白免疫印迹（Western Blotting,WB）和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测ZNF746的表达。通过WB和RT-q PCR检测正常人乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、MDA-MB-415和T-47D）中ZNF746的表达情况。通过慢病毒感染和嘌呤霉素选择产生ZNF746稳定沉默或过表达的MDA-MB-468和MDA-MB-415细胞。通过RT-q PCR和WB检测ZNF746沉默或过表达的效率。采用MTT法、集落形成法、流式细胞仪法和细胞迁移侵袭实验评价ZNF746对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。采用GSEA富集分析乳腺癌公共数据库中ZNF746与Jagged1/Notch通路存在相关性。通过WB分析确定ZNF746对Jagged1/Notch信号通路的影响。使用WB评估肿瘤细胞中Jagged1、NICD、HEY1和HES1的表达。在95例人乳腺癌组织中对ZNF746、CD163和HES1进行了免疫组化染色,搜集这些乳腺癌患者的临床特征。通过细胞共培养、RT-q PCR、流式细胞术确定ZNF746对M2巨噬细胞极化的作用。将Jagged1特异性si RNAs转染到乳腺癌细胞中,证实Jagged1的沉默。我们使用靶向Jagged1的si RNA来抑制Jagged1的表达,通过RT-q PCR和WB测定来确定敲除效率。采用MTT法、细胞迁移侵袭实验、RT-q PCR和细胞共培养确定ZNF746对Jagged1/Notch通路的影响。为了在体内验证ZNF746对乳腺癌细胞的影响,我们在异种移植小鼠模型中评估乳腺肿瘤的体内生长。结果:我们发现在TCGA数据库中ZNF746在乳腺癌组织中显著上调,ZNF746高表达的乳腺癌患者总生存期（Overall Survival,OS）明显低于ZNF746低表达的患者。相较于癌旁组织,ZNF746在乳腺癌组织和细胞中高度表达。ZNF746的过度表达促进了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而在ZNF746敲除的乳腺癌细胞中则显示出相反的效果。为了探讨ZNF746对下游通路的影响,我们应用GSEA富集分析乳腺癌公共数据库中ZNF746的相关通路,我们发现Jagged1/Notch信号通路与ZNF746存在相关性。且在相关性分析中,ZNF746的表达与Jagged1/Notch通路中关键基因NICD呈正相关。我们将ZNF746过表达或沉默,使用Western blot评估肿瘤细胞中与Notch信号通路相关的Jagged1、NICD、HEY1和HES1的表达。结果表明在ZNF746上调后,它们的表达水平在细胞中升高,而在敲除ZNF746后,它们在细胞中的表达水平降低,证明ZNF746上调激活了Jagged1/Notch信号通路。我们进一步在95例人乳腺癌组织中对ZNF746、CD163和HES1进行了免疫组化染色,收集了患者的临床特征,结果发现ZNF746高表达的乳腺癌组织中存在更多的HES1+细胞和CD163+（M2巨噬细胞标志物）细胞,提示ZNF746可能通过Jagged1/Notch信号通路参与乳腺癌M2巨噬细胞极化。此外,ZNF746增强了C-C基趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）和集落刺激因子1（colony stimulating factor 1,CSF1）的产生。来自ZNF746过表达癌细胞的条件培养基促进了巨噬细胞的M2极化,而来自ZNF746沉默癌细胞的条件培养基抑制了巨噬细胞的M2极化,CD206+和CD163+细胞比例分别增高和降低证明了这一点。MTT结果显示,用Jagged1 si RNA转染后,ZNF746诱导的细胞活力增加受到抑制。Jagged1的沉默逆转了ZNF746介导的细胞迁移和侵袭的增加。在Jagged1敲除后,由ZNF746引起的CCL2和CSF1表达升高被抑制。此外,与ZNF746过表达细胞的条件培养基中培养的THP-1细胞相比,在用Jagged1 si RNA转染的ZNF746过表达MDA-MB-468细胞的条件培养基中培养的THP-1细胞中,CD206和CD163的表达以及CD163和CD206阳性细胞的百分比降低。最后我们在建立的裸鼠异种移植瘤模型中发现沉默ZNF746显著降低了肿瘤的生长速度,使肿瘤缩小;而过表达ZNF746显著促进了肿瘤的生长速度,使肿瘤增大。结论:这项研究揭示了ZNF746在乳腺癌中的促肿瘤作用,并证明ZNF746会激活Jagged1/Notch信号通路,ZNF746可以促进肿瘤相关巨噬细胞的M2样极化,ZNF746通过Jagged1/Notch信号传导促进肿瘤相关巨噬细胞的M2样极化促使乳腺癌进展,这表明ZNF746可能是乳腺癌的一个有前途的治疗靶点。