脐腹小蠹伴生菌的拮抗菌筛选与分子检测技术的初步研究

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榆树是我国北方重要的绿化树种和造林树种,在防风固沙、防止水土流失等方面发挥着巨大的生态作用。近年来由于脐腹小蠹虫的危害造成极大的经济损失和生态损失。国内外对于脐腹小蠹的认识和治理多数仍停留在害虫本身,至今还没有对脐腹小蠹的优势伴生菌—茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的生物防治进行研究。因此挖掘有效的生防菌来防治榆树枯死,具有重要的现实意义。  本研究旨在从新疆乌鲁木齐和黑龙江哈尔滨地区受脐腹小蠹危害的榆树树干内分离出对茄腐镰刀菌具有较强生防作用的菌株,研究该菌株的分类地位、发酵液抑菌活性及其最佳抑菌作用培养条件的优化;此外,以脐腹小蠹优势伴生菌的序列为基础,针对茄腐镰刀菌设计特异引物,对茄腐镰刀菌进行初步分子检测,取得了以下结果:  1、本试验采用传统微生物分离培养方法,从采集的榆树树干内分离到17属真菌,6株放线菌和20株细菌。采用平板对峙法,以茄腐镰刀菌为靶标菌株,用所分离的微生物进行拮抗初筛,得到抗茄腐镰刀菌活性较强的细菌3株。进一步对这3株细菌进行复筛,最终确定1株具有较强拮抗性的最优菌株JN1,对茄腐镰刀菌菌丝的抑制率达到53.4%。  2、依据JN1菌株的培养特征、形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析比对,将菌株JN1鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。  3、运用单因素试验和正交试验对JN1菌株的最佳抑菌效果的培养条件进行了优化,筛选到最佳牛肉膏含量为9g/L、最佳蛋白胨含量为14g/L;摇瓶最佳培养条件为:初始pH值为7.0、接种量为4mL/100mL培养基、培养时间为54小时、培养温度为28℃、转速为180 r·min-1。  4、应用设计的1对特异性引物Fsa1和Fsa2对茄腐镰刀菌和其他优势伴生菌进行PCR分子检测,结果表明:特异性引物Fsa1和Fsa2只能够检测出供试菌株中的茄腐镰刀菌;同时检测了特异性引物Fsa1和Fsa2的灵敏度,结果表明该引物对茄腐镰刀菌基因组DNA检测的灵敏度为1fg/μL。
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