猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的表达及间接ELISA检测方法的建立

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猪附红细胞体(Mycoplasma suis)是一种嗜血性支原体,猪附红细胞体病的主要特点是导致母猪繁殖能力下降,仔猪生长速度减慢,还会与其他疾病发生交叉感染,给疾病的诊断带来很大难度。根据GenBank中猪附红细胞体α-烯醇化酶基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了1对特异性引物进行PCR扩增,PCR产物连接至pMD-18T simple Vector,后,再亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体:pVAX1中,构建了原核表达质粒pGEX-4T-Eno和真核表达质粒pVAX-Eno。经SDS-PAGE和Western blot,表明试验所表达蛋白相对分子量为69ku,表达融合蛋白的反应原性很好;真核表达质粒pVAX-Eno转染Vero细胞后,经过IFAT检测,在Vero细胞中产生绿色荧光,表明α-烯醇化酶基因获得瞬时表达。纯化猪附红细胞体α-烯醇化酶基因重组蛋白,以此蛋白为抗原,建立猪附红细胞体重组蛋白间接ELISA检测方法。通过对间接ELISA各反应条件的筛选,确定了抗原最适包被浓度为5μg/mL;待检血清最适稀释度为1:200;HRP-兔抗猪IgG最适稀释度为1:4000;本试验所建立的间接ELISA检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于猪附红细胞体病的抗体检测。本试验为猪附红细胞体病的诊断和防控奠定了基础。
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