一、研究目的及背景：原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有早期诊断难,治疗手段少,病程进展快,病死率高等特点,被称为“癌中之王”,给全社会带来了沉重的疾病负担和巨大的经济损失。目前肝癌最有效的治疗手段是早期手术切除,但在我国大部分病人初次诊断时就已进入中晚期,且多伴严重肝硬化和肝功能异常,使手术治疗受到极大限制。即便是成功实施手术切除的早期病人,肝癌术后复发率也很高,严重影响了患者的生存和总体治疗效果。此外,放疗、介入治疗和肝移植等治疗方法虽然取得一定进展,但总体疗效仍然不能令人满意。这一方面可能与肝癌细胞的多药耐药基因有关,更重要的原因是肝癌的发生发展是一个多步骤多因素的过程,涉及到细胞内的一系列复杂的生物学变化。因而从理论上就可以判断,仅仅针对单一环节的药物或治疗不可能取得理想的治疗效果。即便是代表学科前沿方向的靶向治疗药物,因其作用机制靶向性过强,导致临床适应人群少,且极易出现药物耐药和毒副反应,并未取得预期中的良好疗效。因此,研发针对肿瘤发生、发展多个环节的药物或者研究多种不同机制的药物联合应用的创新疗法成为学科发展的一个重要方向。目前,抗肿瘤药物常见机制包括抑制生长、诱导凋亡和坏死,诱导分化等。遗憾的是,目前常用的抗肝癌药物中,多数抗瘤效果单一,疗效并不明显。因此,研发具有多重抗瘤功能的新药,或者探索多药联合应用的创新疗法对于我国这样一个肝癌的高发国度而言,具有重要的理论意义和应用价值。细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程,通常分为G1、S、G2和M期四个时相。细胞周期中每一事件都是有规律、精确地发生,并且在时间与空间上受到严格调控,该调控效应对基因损伤的及时修复和抑制细胞的恶性增殖有重要意义。细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)两大家族基因控制着细胞周期的进展。Cyclin通过与相应CDK结合而激发后者的激酶活性,被活化的CDK磷酸化细胞周期相关底物,推动周期的进展。例如,Cyclin E-CDK2复合物推动细胞进入S期,Cyclin B-CDK1复合物促进细胞进入M期。CDK受其抑制物CKI (CDK inhibitory protein)的负向调节。CKI包括Cip/kip和INK4a/ARF两大基因家族,它们因能够抑制肿瘤细胞恶性增值而被认为是抑癌基因。Cip/kip家族包括p21,p27和p57,它们通过与Cyclin-CDK复合物结合使其失活,p21通常由抑癌基因p53激活,而p27由一种生长抑制因子TGFβ激活；INK4a/ARF包括p16INK4a和p14ARF,前者能够与CDK4结合而抑制其活性,后者能够防止抑癌基因p53降解。CDK、Cyclin和CKI构成了细胞周期调控的核心机制。近年来,细胞周期异常在肿瘤发生发展中的作用越来越受到国内外研究的关注。研究表明,细胞的增殖、分化、衰老和凋亡均具有一定程度的细胞周期依赖性,几乎所有的肿瘤都有细胞周期调控机制的破坏,导致细胞生长失控、分化受阻、凋亡异常的特征。鉴于细胞周期异常在肿瘤发生发展中的重要作用,国外有学者曾提出肿瘤是一种“细胞周期性疾病”的概念。因此,调节和干预肿瘤细胞的细胞周期,阻滞其生长是目前肿瘤治疗的重要策略之一。研究表明,抑制肿瘤细胞Cyclin的表达,上调CKI表达,均可选择性的抑制肿瘤组织CDK的活性,阻止肿瘤细胞的异常增殖。因而,探索能够特异性抑制肿瘤细胞周期的药物是肿瘤治疗领域的研究热点之一。在这一领域,我国丰富的中医药资源能够给我们提供广阔的研究空间,很多中药都已被证实具有抗肿瘤和细胞周期阻滞作用,但其详细的分子机制和作用机理缺乏深入翔实的探讨和阐述。因此,运用现代分子生物学技术从细胞周期阻滞角度探索抗肿瘤中药的作用机制具有重要的现实意义和应用价值。在本科室以往工作的基础上,我们选择蜂毒的有效活性成分蜂毒素单体作为研究对象。蜂毒素(melittin)是蜂毒的主要活性成分,约占蜂毒干质量的50%。蜂毒素单体是经现代工艺从蜂毒中提取的有效活性成分,纯度可达99%以上。它是由26个氨基酸组成的碱性多肽,其N端和C端分别具有疏水和亲水的生化基团,具有典型的两性分子结构,具有很好的水溶性。近年来随着蜂毒分离、提取、纯化技术的不断提高,对蜂毒素的功能及作用机制的研究也日益广泛。目前的研究主要集中在蜂毒素的抗炎作用上,有研究表明蜂毒素能够通过与NF-kB上游的IkB作用从而抑制NF-kB的活性发挥抗炎作用；也有报道认为蜂毒素能够通过与NF-kB的P50亚基相互作用从而起到抗炎效应；蜂毒素对体内外支原体和衣原体引起的感染也均有抑制作用。我们以前的研究结果证明,携带蜂毒素的重组腺病毒在体外能够抑制肝癌细胞的生长；蜂毒素单体能够抑制肿瘤组织血管生成,且可通过调节Rac1依赖的信号通路来抑制肝癌细胞的转移。进一步研究也表明蜂毒素单体对人肝癌细胞具有明显的凋亡诱导作用,且能促进TRAIL诱导不敏感肝癌细胞出现明显凋亡,相比于单独的蜂毒素处理组和TRAIL处理组均有显著差异。以上研究表明,蜂毒素具有比较广泛的抗瘤活性,其抗瘤机制包括诱导凋亡、抑制转移和血管生成等。在前期预实验过程中,我们还观察到蜂毒素在较低浓度下也能够抑制肝癌细胞生长,同时我们并没有观察到明显的细胞凋亡或者坏死现象。我们利用流式细胞技术检测低浓度蜂毒素刺激后人肝癌细胞的细胞周期分布,发现蜂毒素能阻滞肝癌细胞周期进展,经蜂毒素刺激后人肝癌细胞S期比例明显增加。但是,蜂毒素诱导肝癌细胞周期阻滞的分子机制未见文献报道,该阻滞效应与蜂毒素抗瘤效应的关系也未明晰。因此,我们设计本课题的主要研究目的为：1.观察蜂毒素在较低浓度下对肝癌细胞有无周期阻滞效应；2.探索蜂毒素对肝癌细胞周期阻滞效应的分子机制及其与抗瘤效应的关系。二、研究方法：1、MTT法观察较低浓度下,蜂毒素对人肝癌细胞的生长抑制作用；2、流式细胞仪检测蜂毒素诱导人肝癌细胞周期阻滞效应及其剂量关系；3、Western-blot检测蜂毒素刺激后参与细胞周期调控的相关基因在蛋白水平表达的改变情况,初步探讨蜂毒素诱导周期阻滞的分子机制。三、研究结果：(一)MTT法观察到蜂毒素在较低浓度下(0.5—5.0ug/ml)对多种肝癌细胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)有生长抑制作用。当药物浓度达到5ug/ml、作用时间为24h,蜂毒素对三种肿瘤细胞的抑制均达到30%以上,且镜下未观察到明显细胞坏死现象；(二)流式细胞仪技术检测蜂毒素能够诱导多种人肝癌细胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721) S期阻滞。当药物浓度达到5ug/ml、作用时间为48h,三种细胞S期比例均上升10个百分点以上,且未观察到明显的细胞凋亡峰；(三)Western-Blot技术检测蜂毒素刺激细胞30分钟后,P53、P21、Rb蛋白表达无明显改变,CyclinE、CDK2表达也无明显改变,CyclinA、CyclinD1表达减少,P27表达增加。已知CyclinA和CyclinD1是细胞周期进展的正向调控因子,尤其是前者是细胞顺利通过S期必须的周期蛋白,在该期其表达水平达到峰值。同时,P27因能够与Cyclin-CDK复合物结合而降低其活性,对细胞周期进展具有负向调控作用。由此我们推测,蜂毒素的周期阻滞作用可能通过降低CyclinA、CyclinD1表达,同时增加P27表达有关。四、结论：综上所述,蜂毒素在较低浓度下能够引起肝癌细胞的S期阻滞,其分子机制与CyclinA、CyclinD1及P27的表达变化有关。