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目的:胰腺癌（Pancreatic cancer,PC）有“癌中之王”的称谓,而高转移性及由此导致的高致死率是其恶性表型和不良预后的突出特征。研究和发现与PC肿瘤细胞早期转移相关的新型靶基因、明确其作用的相关分子生物学机制十分必要。KAI1基因作为已获证实的肿瘤抑癌基因之一,具有明确抑制PC肿瘤细胞迁徙和远端转移作用。溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid,LPA）是一种多功能的“磷脂信使”,在肿瘤组织中,LPA与可通过与细胞表面LPA受体（LPAR）结合,调控肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭等多种生物学进程。体内LPA的合成关键酶是自分泌运动因子（Autotaxin,ATX）。研究发现ATX-LPA轴信号通路失调与肿瘤细胞DNA损伤和远端转移密切相关。依据本课题组前期研究发现,结合目前关于各型肿瘤中ATX-LPA轴功能与作用的研究报道,我们推测ATX和LPA及其受体可能是PC转移和预后的新型分子标记物,ATX-LPA轴异常代谢可能与PC的高转移特性相关,而KAI1基因可能通过抑制ATX-LPA轴抑制PC细胞的迁徙和转移。探索和发现ATX-LPA轴信号通路在KAI1抑制PC转移中的作用和相关机制,有可能为PC转移靶向治疗提供新靶点和重要的理论依据,这是有必要深入研究的科学问题。研究方法:1、通过ELISA法检测比较158例PC患者和135例健康对照组的ATX、LPA蛋白血清浓度,检测其表达差异;2、利用PC组织芯片和免疫组织化学方法检测ATX在人PC组织和癌旁组织的表达情况;3、使用重组腺病毒Ad-KAI1感染人PC细胞,以qRT-PCR和Western Blot方法检测不同目标细胞内ATX基因和蛋白的表达情况;收集细胞培养上清,通过ELISA方法检测其中ATX和LPA的含量;4、基于胰腺癌细胞（Miapaca-2,PANC-1）构建慢病毒稳转过表达KAI1基因细胞系（Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1）、Crisper/Cas9技术敲除ATX基因细胞系（Miapaca-2-ATX和PANC-1-ATX）和过表达KAI1基因同时过表达ATX基因细胞系（Miapaca-2-KAI1-ATX和PANC-1-KAI1-ATX）;5、Western Blot和qRT-PCR检测稳转KAI1基因的Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中ATX表达水平;6、ELISA方法检测在过表达KAI1的Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中LPA表达量;Western Blot方法检测LPAR抗体EDG2在过表达KAI1的Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中的表达量;7、Transwell迁移实验和伤口愈合实验验证KAI1基因能否通过抑制ATX蛋白进而抑制PC迁移;8、qRT-PCR验证KAI1-ATX-LPA轴在Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中能够逆转肿瘤EMT作用;9、Western Blot法验证KAI1-ATX-LPA轴在Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中可否抑制P38 MAPK、P44/42 MAPK磷酸化;10、Western Blot法和qRT-PCR法验证KAI1是否通过抑制STAT3信号通路进而抑制ATX-LPA轴;11、Western Blot法验证KAI1-ATX轴体外参与PC耐受化疗药吉西他滨治疗的作用;12、采用胰腺癌细胞构建裸鼠脾注射肝转移模型,ELISA法检测LPA表达水平。应用免疫组化和Western Blot法验证KAI1-ATX-LPA信号轴能够在体内条件下逆转PC的EMT进程;13、基于非靶标超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）平台,采用PC裸鼠肝转移癌模型血清样品,分析不同代谢产物及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集通路。结果:1、KAI1与PC患者及癌细胞中的ATX和LPA表达密切相关PC患者组血清中ATX和LPA浓度分别为381.39±45.92 ng/mL和16.41±9.84ug/mL显著高于健康对照组249.72±21.26 ng/mL（P＜0.001）,11.14±5.13 ug/mL（P=0.005）。考虑到肿瘤分期,T Ⅰ、T Ⅱ组中的ATX表达量显著高于健康对照组（P=0.01）。而T Ⅰ、T Ⅱ组与健康对照组间LPA水平无显著差异（P=0.092）。胰腺癌晚期患者（T Ⅲ、T Ⅳ）与早期患者（T Ⅰ、T Ⅱ）相比,两个标记物均显著升高（P＜0.001;P=0.007）。重组腺病毒Ad-KAI1感染人胰腺癌Miapaca-2细胞后,qRT-PCR和Western blot结果显示KAI1基因可显著抑制ATX mRNA和蛋白的表达。同时,重组腺病毒Ad-KAI1感染人胰腺癌Miapaca-2细胞后收集培养上清,ELISA检测结果显示Ad-KAI1基因可明显下调细胞培养液中ATX和LPA蛋白的表达。Western Blot和qRT-PCR检测发现稳转过表达KAI1基因的Miapaca-2-KAI1和PANC-1-KAI1细胞中ATX和LPA的表达量相较野生型细胞系明显降低。2、KAI1基因可在细胞学水平通过ATX-LPA轴调控PC转移Miapaca-2和PANC-1细胞在过表达KAI1后穿过微孔滤膜或基质胶的细胞数显著少于空白对照组和空载体对照组;在敲除ATX后穿过微孔滤膜或基质胶的肿瘤细胞数显著少于空白对照组和空载体对照组,且敲除ATX组的细胞数多于KAI1组;同时过表达KAI1和ATX（即逆转KAI1基因抑制ATX的效应）组细胞数未见明显变化。伤口愈合实验结果显示:PANC-1细胞在过表达KAI1后愈合速度显著变慢;而在敲除ATX后愈合速度显著变慢,且敲除ATX的愈合速度快于过表达KAI1组;同时过表达KAI1和ATX（即逆转KAI1基因抑制ATX的效应）组细胞数未见明显变化。qRT-PCR检测EMT相关指标结果显示:Miapaca-2和PANC-1细胞在过表达KAI1后E-cadherin表达量升高,EpCAM、Snail和Vimentinl表达量降低;Miapaca-2和PANC-1细胞在敲除ATX后E-cadherin表达量升高,EpCAM、Snail和Vimentinl表达量降低,且敲除ATX的E-cadherin的升高水平和EpCAM、Snail和Vimentinl降低水平均不及过表达KAI1组;同时过表达KAI1和ATX（即逆转KAI1基因抑制ATX的效应）组细胞数未见明显变化。Western Blot结果示KAI1-ATX轴可抑制PC细胞中P38 MAPK、P44/42 MAPK通路磷酸化。Western Blot和qRT-PCR结果发现STAT3基因能够促进ATX的表达。Western Blot结果显示Miapaca-2细胞系和PANC-1细胞系在过表达KAI1后Src磷酸化水平收到抑制;STAT3的表达量也受到抑制,上述发现提示KAI1基因能够抑制STAT3的表达。同时,Western Blot结果显示低表达KAI1-ATX会加速PC细胞对吉西他滨的耐药性。3、KAI1基因在裸鼠肝转移癌模型动物体内通过ATX-LPA轴调控PC转移在使用PANC-1,PANC-1-KAI1和PANC-1-ATX构建的裸鼠胰腺癌肝转移模型中,ELISA结果示:在过表达KAI1和敲除ATX的裸鼠模型血清中LPA表达量均降低,而敲除ATX组降低更多。免疫组化和Western Blot法证实在裸鼠肝转移模型中,KAI1-ATX轴具有体内逆转肿瘤EMT作用。全谱代谢组学显示KAI1-ATX信号轴可影响PC肝转移血清中脂质代谢过程。在检测到的1233个代谢物中,NC-Pancreas vs.KAI1-pancreas组有187个代谢物（178个上调,9个下调）存在差异。NC-Pancreas vs.ATX-pancreas组有105个代谢物（95个上调,10个下调）存在差异。韦恩图显示NC-Pancreas vs.KAI1-pancreas组和NC-Pancreas vs.ATX-pancreas组共同的差异代谢物有86种。KEGG通路富集分析发现NC-Pancreas vs.KAI1-Pancreas和NC-Pancreas vs.ATXPancreas经KEGG通路富集分析后其得到的富集通路完全一致,均为脂质代谢相关通路,且通路中的差异代谢物也完全一致,分别为甘油三酯TG,甘油二酯DG和前列腺素PGE2。结论:1、临床与体内外研究显示抑癌基因KAI1/CD82在PC和癌细胞中与ATX和LPA表达密切相关。2、在体外细胞学水平,KAI1基因可抑制ATXLPA轴介导的PC细胞的迁移和侵袭;其深层机制包括:（1）KAI1-ATX信号轴参与了P38 MAPK、P44/42 MAPK磷酸化抑制过程,而受抑的P38 MAPK及P44/42 MAPK磷酸化通路,可能是KAI1通过敲低ATX逆转胰腺癌细胞EMT过程的内在原因;（2）KAI1基因能够抑制STAT3的表达,进而抑制ATX表达,最终抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。此外,PC对于吉西他滨治疗产生的耐药现象可能与KAI1和ATX表达均减少有关。3、在体内动物模型水平,KAI1基因能够抑制PC肝转移裸鼠癌组织中LPA的表达;同时,KAI1-ATX轴能够逆转PC肝转移模型动物肿瘤组织EMT效应;而脂质代谢途径可能是KAI1-ATX轴调控PC肝转移的主要代谢组学靶途径。上述的研究阐明了KAI1基因通过ATX-LPA轴调控PC转移的作用及相关机制。