目的:红芪是甘肃道地药材之一,具有固表止汗,补气利尿,托毒敛疮等功效。临床上常用来治疗气虚、多汗、慢性肾炎及心脏病等疾病,效果显著。其活性成分主要有糖类、黄酮类及苯丙素类等,其中红芪多糖是主要活性成分之一,药理作用尤为广泛。随着人口的老龄化,骨关节炎是人类疾病史上的常见疾病之一,发病率约占总人口的20%,已严重影响到人们的生活质量,目前临床上常用膝关节处注射透明质酸钠缓解其症状。本课题前期已发现红芪总多糖对骨关节炎有明显的治疗作用,另外临床证明透明质酸钠治疗骨关节炎也有效,预测经葡聚糖凝胶色谱分离纯化后的红芪多糖与以透明质酸钠为基质的水凝胶联用对骨关节炎有更好地治疗作用。因此本课题研究从红芪多糖的纯化分离及药理作用出发,联合透明质酸水凝胶探讨红芪多糖对大鼠骨关节炎的治疗作用,研究红芪多糖在骨基础方面的治疗机制,进一步扩大多糖的开发利用。方法:1.前期实验采用煎煮法提取红芪总多糖溶液,并用多次醇沉、丙酮脱色等对其进行初步纯化得到红芪粗多糖。后续再利用Sevage法除去蛋白,得到脱蛋白红芪多糖。2.采用SephadexG-25色谱法对脱蛋白红芪多糖进行分离,蒸馏水洗脱,流速为0.8mL/min,每3mL收集洗脱液,苯酚-浓硫酸法跟踪检测,测定A值,绘制洗脱曲线。合并主峰流出液,浓缩并醇沉,静置抽滤,丙酮脱色后干燥得到红芪多糖HG-2。采用茚三酮反应、碘-碘化钾反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别红芪多糖HG-2的纯度。3.采用薄层色谱、红外光谱等对红芪多糖HG-2进行初步定性分析;采用HPLC及GC-MS技术对红芪多糖HG-2进行组成分分析,并计算各单糖的摩尔比。4.考察不同区间温度下各单糖对照品与样品红芪多糖HG-2线性变化,选取合适的对照品,采用苯酚-浓硫酸法测定红芪总多糖及红芪多糖HG-2的含量。5.将透明质酸钠(HA)进行甲基丙烯酸酯化,调节pH值至8-8.5,保持12h,透析,冷冻干燥得到甲基丙烯酸酯化的透明质酸(MeHA),蒸馏水溶解,依次加入适当浓度的过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液,胶凝后得到透明质酸水凝胶;用一定浓度的红芪多糖HG-2溶液溶解MeHA,依次加入过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺溶液胶凝得到红芪多糖HG-2HA水凝胶。并测定红芪多糖HG-2HA水凝胶的凝胶时间、溶胀率、释药、体外酶降解速率等参数。6.复制大鼠骨关节炎模型(采用膝关节处注射木瓜蛋白酶的方法),动物分组后分别给予对应的药物干扰,观察红芪多糖HG-2、HA水凝胶、红芪多糖HG-2HA水凝胶对大鼠骨关节炎的治疗作用。结果:1.水提醇沉得到的红芪总多糖粉末呈灰白色,质地较松散;脱蛋白后的红芪多糖呈类白色,质地松散,脱蛋白率为50.8%。2.采用Sephadex G-25色谱法分离红芪总多糖,洗脱曲线显示只有一个梯度的洗脱峰,初步判断分离得到了一个分子量段的红芪多糖,得率为20.05%。综合茚三酮反应、碘-碘化钾反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,说明红芪多糖HG-2是纯度较高的一种多糖。3.通过薄层色谱初步判断红芪多糖HG-2由不同的单糖组成。水解后的红芪多糖HG-2显示出葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖3个斑点;IR谱图显示红芪多糖HG-2满足多糖的一般特征;组成分析中HPLC图谱只显示出葡萄糖和另一未知峰,因此GC-MS进一步分析显示红芪多糖HG-2由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、葡萄糖组成,其摩尔比依次为3:12:0.1:0.6:17,其中葡萄糖占比最高。4.通过各对照品与供试品红芪多糖HG-2的k值对比,最终选取葡萄糖为对照品,苯酚-浓硫酸法测得红芪多糖HG-2的含量为95.97%。5.透明质酸钠制备MeHA,得率为99.80%;红芪多糖HG-2HA水凝胶的胶凝时间为3min±10s,溶胀率为46.43%,第5天红芪多糖HG-2的释药量达到86.15%,并在第5天已基本降解。6.药理实验结果显示,红芪多糖HG-2(HHG-2)能明显扩大OA大鼠膝关节的伸展角度,改善关节病理变化,减小关节滑膜厚度,提高滑膜中糖胺多糖的含量;同时HHG-2可降低关节灌洗液中炎性细胞及IL-1β、IL-6、TNF-α水平。另一方面,将2次的HHG-2药量置于HA水凝胶之中,将一周2次给药改为一周1次,考察不同给药状态下的HHG-2对大鼠骨关节炎的治疗作用。结果显示,将HHG-2置于HA水凝胶之中一周给一次药与单独一周给HHG-1两次对OA的治疗作用相似,提示HHG-2透明质酸水凝胶治疗OA时可减少用药次数,临床使用更加方便。结论:本实验利用Sephadex G-25色谱分离纯化得到纯度较高的红芪多糖HG-2,并通过薄层、红外、HPLC、GC-MS等手段发现由5种不同的单糖组成,其中以葡萄糖占比最大。药理实验显示红芪多糖HG-2对骨关节炎有治疗作用,联合应用HA水凝胶后,其作用相对于红芪多糖HG-2明显增加,并可减少给药次数,为红芪多糖在骨基础的研究提供了理论依据。