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内毒素(Endotoxin,ET)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,由亲水性的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)共价结合疏水性的类脂A组成。是人体重要的致炎物质。当机体遭受烧伤、创伤、感染及血液透析时,非常容易因感染发展为内毒素血症,其病死率超过30%。在某种程度上说,造成病人的最后死亡是因为缺乏一种可靠、灵敏和定量的检测方法。用于内毒素检测的方法已有较多报道,但还远不能满足当前临床检验和食品、制药、环境等领域的需要,因为这些方法存在不同程度的问题,如操作繁琐、费时、灵敏度低、定量性差、自动化程度低;或需要标记、装置复杂且昂贵等。研究一种灵敏度高、简便、定量性好且低廉的检测方法仍是一件很有价值的工作。
压电石英晶体生物传感器是一种高灵敏度的传感装置,能响应晶体表面的质量负载以及液体粘度、密度、电导率以及介电常数等物理参数的变化。而且装置低廉、操作简单、易与实现与计算机接口,具备理想的生物传感器的许多特点。压电石英晶体根据其响应机理,分为质量效应型和非质量效应型。由于质量效应型传感器具有很高的质量灵敏度,也被称为石英晶体微天平,非常适合生物大分子的测定。质量效应型压电传感器通常在晶体表面固定化一层载体,通过载体固定能与待测生物物质选择性结合物质,响应待测生物物质通过特异性结合反应引起微小质量变化,这种方法无需任何标记物,直接响应物质的质量,方法很简单。非质量效应型传感器通过被测物中加入一些促使混合液物理性质发生变化的生物物质,通过测量这些物理参数变化引起的晶体谐振频率变化间接测量待测物的浓度。这一方法也不需要标记,而且还省去了固定化步骤,方法更简单且易于实现在线检测。本论文拟利用上述两种原理,研制成两种定量、准确、灵敏地检测内毒素的检测方法。具体内容主要包括以下几个方面:
(1)采用一维三层结构模型,推导出石英晶体传感器在同时存在质量负载效应和粘性耦合效应下的力学模型和等效电路模型。结果与Martin采用连续机电模型得到的结果相似,为理解液相压电石英晶体传感器的振荡提供了基础。
(2)设计新的石英晶体振荡电路,提高了晶体振荡频率的稳定性,从而提高了测量信号的信噪比,并且该电路能在气液两相中稳定工作;利用复杂可编程逻辑器件(CPLD)构建具有能与计算机进行串行通信功能的频率计数器,克服传统检测方法采用商用频率计数器存在体积大、成本高以及集成化低等缺陷;测量软件采用虚拟仪器编程软件(LABVIEWTM)编制,软件的主要功能包括:数据采集、数据显示与保存以及数据分析和处理等,克服传统方法花费大量时间进行数据输入和处理的缺点,实现了测量的智能化。
(3)在石英晶体电极表面通过固定3-ATPES偶联戊二醛,从而将PMB固定到晶体表面。主要考察了PMB与内毒素的亲和吸附性能以及传感器用于内毒素的检测的选择性、灵敏度、检测范围、重现性和再生能力等技术指标。结果表明利用该方法研制的传感器的检测范围为5.0~20μg/ml;灵敏度约8Hz/(μg/ml)。
(4)采用分子自组装成膜技术,在石英晶体金电极表面自组装一带羧基的巯基自组装单层膜(分别采用巯基丙酸、11-巯基-11烷酸和16-巯基-16烷酸),共价键合固定PMB。主要考察了影响巯基自组装的因素、PMB的最佳固定化条件以及传感器用于内毒素的检测的选择性、灵敏度、检测范围、重现性和再生能力等技术指标。同时还考察了不同长度碳链的自组装膜对传感器灵敏度的影响。结果表明利用该方法研制的传感器的检测范围2.0~20μg/ml;随自组装分子碳链长度增加,传感器的灵敏度有所提高,其中16-巯基-16烷酸自组装固定法的传感器灵敏度到达12.4Hz/(μg/ml)。
(5)为了进一步提高传感器的灵敏度和降低传感器检测下限。提出了一种质量放大方法一自组装纳米金颗粒法。重点研究该了自组装纳米金颗粒的条件,PMB最佳固定化条件以及传感器灵敏度和检测下限改善情况,实验结果表明该传感器的检测范围为0.4~10μg/ml;灵敏度为42.1Hz/(μg/ml)
(6)根据内毒素与鲎试剂混合发生凝胶反应引起液体流变学性质(粘度与密度)变化,而石英晶体能灵敏地响应这种变化。开发出一种基于液体粘性耦合效应的内毒素生物传感器。重点研究了表面抛光和亲水性处理对传感器谐振频移的影响;评价了不同标定方法的优劣。实验结果表明,对于采用液相振荡的传感器表面进行光滑和亲水性处理能提高传感器测量的准确性和液固粘性耦合性能;提出的‘拐点’标定法得到了最佳的标定曲线,其相关系数达-0.996。这种内毒素检传感器的检测下限可达0.1pg/ml。能满足许多检测领域对内毒素检测下限低的要求。