目的:唾液腺腺样囊性癌(SACC)是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一,好发于腭部小唾液腺及腮腺,其特点是虽生长相对缓慢,但侵袭性强,肿瘤易沿神经扩散,浸润性极强,与周围组织无明显界限,肿瘤易侵入血管,造成血行性转移,转移率高达40%,转移部位以肺为最多见。由于上述特性,该肿瘤常不易手术切净,术后局部复发和远处转移率高,远处转移患者的生存率低于未转移者。目前尚无确切的判断预后的指标。随着基因组学等生物科学的发展,寻找对于腺样囊性癌侵袭和转移具有特异性的肿瘤标记物可能会对该病的治疗和预后评估产生重要意义。肿瘤的侵袭、转移机制非常复杂。近年来的研究发现肿瘤微环境(Tumor Microenvironment)对肿瘤细胞的侵袭和转移有促进作用,肿瘤微环境可以通过改变细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的组成成分,从而改变细胞的粘附、迁移;然而肿瘤微环境对肿瘤的进展也可能起到抑制作用,从而降低其侵袭和迁移的能力。在肿瘤向邻近组织浸润以及远隔脏器转移的过程中,发挥关键作用的不仅是肿瘤对基底膜的浸润还有其与细胞外基质的相互作用。纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是位于基底膜表面的常见受体,当肿瘤细胞发生远处转移时,肿瘤细胞膜受体先与其结合,继而通过分泌基质金属蛋白酶等降解酶来降解基底膜和细胞外基质,肿瘤细胞才能突破细胞外基质向远处转移,最终实现肿瘤的远处转移。肿瘤细胞在转移过程中与ECM的关系主要表现为与ECM的黏附及对ECM的侵袭,尤其与ECM中纤维粘连蛋白的结构和功能变化有关。纤维粘连蛋白是一种多功能的糖蛋白,具有多种生物学活性和功能。它是基底膜的重要组成部分,也是细胞外基质中的重要细胞粘附分子,在细胞与细胞外基质的粘附过程中充当媒介,对细胞的生长及分化和运动能力的改变发挥调控作用,与此同时,还能左右肿瘤细胞的粘附与远处转移,在细胞的迁移与增殖等功能方面发挥促进作用。近年来,肿瘤的侵袭及转移一直都是研究的热点问题,现已证实在此过程中肿瘤细胞不可避免要与细胞外基质相接触并相互作用,FN的粘附与介导在此过程中起着不容忽视的作用。在以往腺样囊性癌的相关研究中显示肿瘤细胞巢细胞外基质中的FN为强阳性表达;SACC细胞能够生成FN的作用也已经被体外实验所证实;原本呈现低转移潜能的SACC细胞系在加入外源性FN后,其移动性和粘附率被发现明显升高。鉴于以上研究结果学者们一致认为FN在SACC的发生发展过程中起重要的调节作用,可能是其侵袭和转移的关键因素,但是关于FN在SACC中基因调控的机制等方面的研究仍需进一步探讨。BTB/POZ 结构域蛋白 7(BTB/POZ domain containing 7,BTBD7)为含有两个保守BTB/POZ蛋白序列的蛋白质,其内包含明显的转录因子结合位点,研究发现BTBD7蛋白能促进唾液腺和肺脏、肾脏等器官的分支结构的形成。在上皮细胞分支形态发生变化的过程中,基质中的FN调控着上皮细胞中BTBD7的变化,大量FN的聚集会导致BTBD7的表达,进而促进形成分支结构,沉默BTBD7会使唾液腺、肺、肾等分支器官的发育明显受到抑制。后有研究显示BTBD7在调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化(EMT)中起关键性作用,BTBD7促进了 EMT的进程,加快了肿瘤的侵袭和转移。相关的研究在肝癌、肺癌、乳腺癌中均有报道,在肝癌的研究过程中发现沉默BTBD7会导致纤维粘连蛋白表达降低,然而,在唾液腺腺样囊性癌中BTBD7和FN这两个均能影响肿瘤侵袭和转移的基因的表达及二者之间的调控关系至今未见报道。本研究通过免疫组化技术检测BTBD7和FN在正常唾液腺组织及唾液腺腺样囊性癌组织中的表达,分析BTBD7和FN的表达与临床病理因素和预后之间的关系,旨在检测这两种蛋白表达水平的高低在SACC病情进展中所表达的意义。通过免疫荧光技术检测人唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-83及由其克隆出的高转移细胞系SACC-LM中BTBD7和FN的表达情况,以确定采用哪种细胞系进行基因沉默,然后利用小干扰RNA技术分别沉默SACC-LM细胞系中的BTBD7和FN基因,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中对应的FN和BTBD7的mRNA和蛋白表达水平,以确定两种蛋白之间的调控关系。通过Transwell侵袭实验和细胞划痕实验验证沉默BTBD7对高转移细胞系SACC-LM体外侵袭、转移能力等生物学行为的影响,进一步探讨BTBD7和FN在SACC中的调控机制,确定对于腺样囊性癌侵袭和转移具有特异性的肿瘤标记物,为SACC的治疗提供新的靶点进行干预,降低肿瘤发生侵袭和转移的机率,提高肿瘤患者的生活质量。方法:1.收集16例正常的唾液腺组织蜡块和手术切除的SACC组织蜡块70例及其相关的临床资料,采用免疫组织化学染色法检测BTBD7及FN蛋白在正常唾液腺组织中和唾液腺腺样囊性癌组织中的表达,统计学分析两种蛋白在唾液腺腺样囊性癌中表达的相关性,以及与患者临床病理特征(肿瘤类型、TNM分期等)之间的相关性。2.采用Kaplan-Meier生存分析法分析BTBD7阴性表达和阳性表达SACC患者生存率的差异性。3.细胞免疫荧光技术检测BTBD7及FN在SACC-83细胞系及SACC-LM细胞系中的表达情况。4.利用SiRNA技术对SACC-LM细胞中的BTBD7基因进行沉默,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中FN基因的mRNA和蛋白的改变情况。5.利用SiRNA技术对SACC-LM细胞中的FN基因进行沉默,通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中BTBD7基因的mRNA和蛋白的改变情况。6.采用Transwell侵袭实验和细胞划痕试验检测BTBD7基因沉默后SACC-LM细胞侵袭和迁移能力的改变情况结果:1.免疫组化结果显示,在正常唾液腺组织中,BTBD7表达阴性或呈弱表达,阳性表达率仅为12.5%,而FN的阳性表达率高达93.8%,在SACC组织中,BTBD7蛋白呈高表达,其阳性表达率为55.7%,而FN多为低表达或不表达,其阳性表达率仅为27.1%,尤其在实体型肿瘤组织中,FN的阳性表达率为10.0%,BTBD7的阳性表达率为70.0%,结果显示无论在正常组织还是SACC组织中BTBD7和FN的表达均呈显著负相关。BTBD7和FN的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性,与肿瘤的区域性淋巴结转移、病理类型及远处转移呈显著相关。2.腺样囊性癌患者术后的随访时间平均为六年(12-89月),29名患者死于腺样囊性癌肿瘤的复发或转移,9名患者失访,32名患者到随访截止日仍存活。Kaplan-Meier生存曲线显示,BTBD7表达阳性患者的总体生存率明显低于阴性患者。3.细胞免疫荧光染色显示,BTBD7和FN在SACC-LM细胞系和SACC-83细胞系中均有表达。但两种蛋白均在高转移细胞系SACC-LM中表达更强。4.沉默SACC-LM细胞中的BTBD7基因,利用qRT-PCR技术和Western Bolt技术检测发现,BTBD7基因沉默后,FN的mRNA及蛋白的表达明显升高。5.沉默SACC-LM细胞中的FN基因,利用qRT-PCR技术和Western Bolt技术检测发现,FN基因沉默后,BTBD7的mRNA及蛋白的表达无明显变化。6.BTBD7基因沉默后,明显抑制了 SACC-LM细胞的侵袭和迁移能力。结论:在唾液腺腺样囊性癌组织中,BTBD7和FN的表达呈负性相关,BTBD7的高表达和FN的低表达与腺样囊性癌的病理类型及是否发生转移显著相关;在SACC-LM细胞系中,BTBD7基因沉默后FN的表达显著提高,肿瘤细胞的侵袭和迁移能力减弱,提示我们BTBD7可能通过调控FN的表达改变了唾液腺腺样囊性癌肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,减少肿瘤侵袭及远处转移。通过本研究,为唾液腺腺样囊性癌的临床诊断、预后判断以及生物治疗方案的制定提供新的方案。