背景癌症是一种以不受控制的细胞增殖为特征的疾病,是世界范围内的主要死亡因素。肝细胞癌（HCC）是全球最常见的肿瘤类型之一。尽管大多数HCC病例出现在亚洲和非洲的发展中国家,但西欧和美国的HCC病例正以惊人的速度在增长。慢性肝病、病毒性肝炎、酒精中毒以及饮食中的致癌物（如黄曲霉毒素和亚硝胺）均会导致肝癌。HCC最常在氧化应激和炎症的环境中发生和进展。细胞衰老可能与诸如肝癌之类的肝脏疾病的发生和发展有关。在晚期慢性肝病中缺乏免疫清除衰老细胞的作用,导致衰老肝细胞大量积累以形成具有丰富衰老相关分泌表型（senescence associated secretory phenotype,SASP）的微环境,进而可能促进相邻DNA损伤和衰老前期肝细胞中肿瘤的发生。肝移植和手术切除是最常见的治疗选择。领先的化学药物（索拉非尼、阿霉素等）不能使肝癌患者平均六个月的生存时间增加,并且在化疗过程中发现了衰老癌细胞数量的增加,引起化疗抵抗和SASP。因此,我们迫切的需要研究和评估可能替代的化学预防和治疗策略,这些策略称为衰老细胞裂解（senolytics）可选择性地去除衰老细胞,并有效地控制肝癌,缓解多种与年龄有关的表型。由于癌症是一种多因素疾病,因此可能需要使用能够靶向多种细胞内成分的化合物进行治疗。从过去几年的广泛研究中发现,某些植物衍生物包括多酚,具有抗癌活性。大量研究报道,姜黄素、白藜芦醇、咖啡因和类黄酮等生物活性分子在抑制肿瘤方面具有潜在的治疗功效。因此,这些多酚抗癌活性背后可能的分子机制应受到重视。这也将支持多酚可用于癌症预防和治疗的观点。姜黄素是来自姜黄根茎的主要多酚类姜黄素化合物。姜黄长期以来一直被用于治疗几种慢性疾病,例如肿瘤和神经退行性疾病。过去几十年的大量研究表明,姜黄素是一种有效的抗炎药并对多种癌症具有强大的治疗潜力。它通过调节各种转录因子（如生长因子、炎性细胞因子）和蛋白激酶及其他酶来抑制人类肿瘤的增殖和转移。它诱导凋亡细胞死亡,并通过细胞周期停滞来抑制癌细胞的增殖。此外,姜黄素及其类似物具有一定的抗衰老活性,包括减轻衰老症状和延缓与细胞衰老直接参与的衰老相关疾病的发展。但是其作用机理尚未完全阐明。尽管有这些令人鼓舞的发现,但仍需要具有改善的治疗特性的新姜黄素类似物来满足治疗要求。3,5-（E）-双（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）-4-哌啶酮盐酸盐（C0818）是新型的姜黄素类似物,比姜黄素更有效。热休克蛋白（HSP）在癌症中高水平表达,并形成对肿瘤发展必不可少的培育环境。热休克蛋白90（Hsp90）是最常见的分子伴侣之一,其功能是使许多对肿瘤发展至关重要的癌蛋白成熟并维持其在细胞内的稳定性。在这方面,癌细胞高度依赖Hsp90的伴侣功能以维持生存和增殖。此外,已知衰老细胞,如癌细胞,采用促存活途径,其至少可部分归因于HSP90及其对其客户蛋白的稳定作用。因此,Hsp90被认为是通过靶向各种信号传导途径而成为癌症治疗的有希望的靶标,并且抑制分子伴侣Hsp90代表了各种类型癌症的有希望的化学治疗策略。此外,Hsp90抑制剂除了作为抗肿瘤剂的原始活性外,还显示了作为抗衰老药物的作用。然而,Hsp90的临床意义和在HCC中调节Hsp90促肿瘤作用的机制,Hsp90在衰老发展中的作用以及开发Hsp90抑制剂作为HCC衰老细胞中的抗衰老剂的优势仍然不清楚。这项研究将研究体外抑制人类肝癌细胞生长与Hsp90之间的相关性,并通过确定Hsp90抑制剂C0818诱导HCC细胞中Hsp90客户蛋白降解的机理,及其对靶向线粒体介导的癌细胞能量代谢的影响,来评估C0818的作用。此外,通过验证C0818具有由抑制衰老癌症细胞中Hsp90和自噬的作用介导的其杀死衰老细胞或抑制衰老相关分泌表型（SASP）的能力,证明C0818可作为靶向阿霉素诱导的肝细胞癌衰老细胞的新的衰老细胞裂解剂（senolytics）。方法使用了人类肝细胞癌Hep G2和Sk-Hep-1细胞系。用0.125μg/m L的阿霉素（ADR）处理细胞,在Hep G2和Sk-Hep-1细胞系中诱导细胞衰老,在48小时后将ADR冲洗掉,并将细胞在正常培养基中再培养5天。使用MTT、集落形成和Ed U掺入测定法评估细胞活力。使用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分析、线粒体膜电位（MMP）损失和ROS生成的定量。使用蛋白质印迹法检测Hsp90客户蛋白的表达、参与凋亡的蛋白、调节细胞周期的蛋白、调节氧化应激的蛋白、调节能量代谢和线粒体质量的蛋白、分子衰老标志物和DNA损伤标志物的蛋白、自噬相关蛋白以及调节SASP变化的蛋白。为了进一步验证Hsp90在肝癌细胞存活和衰老诱导中的重要作用,我们将靶向Hsp90的si RNA转染到Hep G2和SkHep-1细胞系中。为了证实caspase激活在C0818诱导的细胞死亡中的重要性,我们用caspase抑制剂z-VAD-fmk对Hep G2和Sk-Hep-1进行了预处理。为了研究C0818诱导消耗Hsp90客户蛋白质的潜在分子机制,在存在或不存在C0818的情况下,使用了环己酰亚胺（蛋白质合成抑制剂）、MG132（蛋白酶体抑制剂）和NH4Cl（溶酶体抑制剂）。进行免疫沉淀（IP）实验,研究C0818对Hsp90伴侣功能的影响。以GAPDH为对照,采用实时荧光定量PCR检测Hsp90客户Raf-1和Akt以及衰老标志物P21、P16和IL6的m RNA表达水平。为了进一步分析ROS的作用,使用了ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）来抑制细胞内ROS的积累。使用ATP测定试剂盒测量细胞ATP的水平。为了量化衰老,使用比色底物Xgal测定了溶酶体β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性。ELISA用于定量SASP的水平。为了阐明C0818对自噬通量的调节,将衰老的HCC细胞用常见的自噬诱导剂雷帕霉素、溶酶体抑制剂氯喹（CQ）和巴菲洛霉素A1（Baf）处理。结果（1）C0818对肝癌细胞增殖的抑制作用。Hep G2和Sk-Hep-1细胞在48 h时C0818和姜黄素的IC50值分别为2.1μmol/L和19.3μmol/L、1.9μmol/L和19μmol/L。在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中均观察到了C0818对集落形成的剂量依赖性抑制作用,并且在两种细胞系中最高剂量的C0818几乎完全抑制集落的形成。发现C0818在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中剂量依赖性地增加诱导的早期和晚期凋亡细胞百分比。Click-i T EDU增殖测定表明,C0818以剂量依赖性方式显著抑制Hep G2和Sk-Hep-1细胞中的DNA合成。C0818在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中均以剂量依赖性方式诱导了明显的G2/M期阻滞。在G2/M期的细胞百分比的增加与在S期和G0/G1期的细胞百分比的减少是一致的。Cdc2、P-Cdc2（Thr161）、Cyclin B1和Cdc25c的表达水平被下调,而P21被C0818上调。（2）C0818诱导肝癌细胞凋亡。蛋白质印迹分析表明,C0818在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中均以剂量和时间依赖性方式诱导caspase-3、-7、-8和-9和PARP的裂解增加。z-VAD-fmk显著抑制了C0818诱导的PARP和caspase-3的裂解。此外,z-VAD-fmk阻止了C0818诱导的细胞死亡和凋亡,这表明C0818诱导的HCC细胞凋亡是caspase依赖性的。（3）C0818降解肝癌细胞Hsp90的客户蛋白依赖于蛋白酶体。Hsp90的敲低大大降低了HCC细胞的生存能力。发现C0818以剂量和时间依赖性降低了Hep G2和Sk-Hep-1细胞中RAS、C-Raf、PC-Raf、Erk、P-ERK、MEK、P-MEK、PI3K、AKT、P-AKT、mTOR和P-mTOR的水平。当新的蛋白质合成被Hex G2和Sk-Hep-1细胞中的环己酰亚胺（CHX）抑制时,C0818更快地降解C-Raf,这表明C0818诱导了C-Raf降解而不是抑制了蛋白质合成发现用蛋白酶体抑制剂MG132处理完全阻断了C0818诱导的C-Raf和AKT的降解。另外,在两个细胞中用溶酶体抑制剂NH 4 Cl处理都不会影响降解,表明C0818通过蛋白酶体而不是溶酶体诱导了Hsp90客户的降解。此外,在使用si RNA下调Hsp90的表达后,C0818无法促进C-Raf和AKT蛋白的降解,这表明Hsp90是C0818的直接靶标。（4）C0818通过干扰Hsp90的分子伴侣功能引起Hsp90客户蛋白的降解。免疫沉淀（IP）实验表明,C0818抑制C-Raf和AKT与Hsp90的结合并诱导其被蛋白酶体降解。另外,C0818对Hsp90客户蛋白如C-Raf和AKT的转录没有明显作用。（5）C0818诱导肝癌细胞线粒体凋亡依赖于ROS。C0818可以在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中以剂量和时间依赖性上调Bax/Bcl-2比率,并且在两种细胞系中剂量依赖性诱导MMP显著降低。C0818处理48小时后,流式细胞仪分析显示两种细胞系中ROS的产生均呈剂量依赖性显著增加。C0818以剂量依赖性方式下调PINK1的水平和线粒体细胞色素c向HCC细胞的细胞质中释放。Annexin V–APC/PI染色的结果表明,用NAC预处理可以显著减弱凋亡细胞的百分比。此外,通过NAC预处理可以部分逆转Bax、Bcl2、cleaved PARP和cleaved caspase 9的表达水平的变化。NAC预处理可明显降低C0818诱导的细胞生长抑制,表明C0818诱导ROS依赖性HCC细胞毒性。（6）C0818抑制肝癌细胞ATP的产生。发现C0818在Hep G2和Sk-Hep-1细胞中均以剂量和时间依赖性降低AMPK、P-AMPK的水平和增加TOMM20的水平。C0818在24小时后诱导ATP水平显著降低,并且在C0818处理48小时后观察到ATP几乎完全耗尽,这表明C0818在HCC细胞中诱导了线粒体功能障碍。（7）C0818清除阿霉素诱导的衰老肝癌细胞。通过测量在ADR处理的Hep G2和Sk-Hep-1细胞中的衰老标志物证实细胞衰老,包括细胞周期抑制物p21 Cip1/Waf1、p16Ink4a、P53的表达增加和DNA损伤标志物γ-H2AX的表达增加。C0818在ADR诱导的肝细胞癌衰老细胞中显示出明显的抗衰老活性。通过SA-β-Gal染色证实,C0818浓度依赖性诱导Hep G2和Sk-Hep-1衰老细胞中染色细胞的密度和数量的显著降低。用C0818处理后,Hep G2和Sk-Hep-1衰老细胞中的P16INK4a和p21Cip1/Waf1的m RNA水平以浓度依赖的方式显著下调。（8）C0818诱导衰老肝癌细胞线粒体介导的凋亡。C0818处理增加了衰老细胞中Annexin-V阳性细胞的数量。Western印迹分析显示衰老细胞中活化的caspase-7、caspase-8的水平升高以及聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的降解。泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk显著降低了C0818诱导的衰老细胞凋亡。zVAD-fmk在衰老细胞中显著抑制了C0818诱导的PARP和caspase-8的裂解。C0818处理衰老细胞,观察到浓度依赖性的线粒体膜电位的降低和Bcl-2的下调,这表明C0818通过线粒体介导的途径在衰老的HCC细胞中诱导了caspase依赖的凋亡。与对照HCC细胞相比,ADR处理的细胞中AKT及其活化形式P-AKT（Ser473）被上调。（9）C0818通过抑制Hsp90清除衰老肝癌细胞。C0818能够降低衰老细胞中AKT和P-AKT的水平。敲低HSP90诱导衰老细胞凋亡并降低AKT和P-AKT的水平,这表明C0818诱导衰老HCC细胞凋亡是Hsp90依赖性的。（10）C0818抑制衰老肝癌细胞的晚期自噬独立于Hsp90的抑制。C0818以浓度依赖的方式显著增加衰老细胞中LC3II的积累、增加p62的水平并降低Beclin1和ATG5的水平。自噬诱导剂雷帕霉素降低了P62的表达,而C0818增加了P62的表达,这与自噬抑制剂氯喹和巴非霉素相一致。所有测试的药物均增加了LC3II的积累。此外,与单独使用C0818相比,当用C0818联合雷帕霉素处理细胞时,P62的积累被下调,这表明C0818在衰老的HCC细胞的晚期抑制自噬。C0818诱导p62的上调;而17-AAG降低了p62的表达水平。用靶向Hsp90的si RNA转染衰老细胞可降低Hsp90表达。敲低Hsp90后,C0818仍可有效诱导p62上调和LC3II积累,表明C0818对自噬的抑制独立于Hsp90。（11）C0818通过抑制NF-κB、P38、ERK和mTOR信号通路来调节HCC衰老细胞中的SASP。使用ELISA和实时定量PCR分析SASP的典型标志物表明,C0818显著抑制IL-6的表达。C0818显著下调衰老细胞中表达水平的NF-κB及其磷酸化形式。另外,C0818不仅抑制NF-κB活化,而且诱导MAPK相关蛋白P38和Erk表达水平的下调。此外,C0818在衰老细胞中以剂量依赖的方式诱导了mTOR及其磷酸化形式的下调,提示C0818通过抑制NF-κB、P38、ERK和mTOR信号通路来调节HCC衰老细胞中的SASP。结论C0818通过抑制HCC细胞中的PI3K/AKT和RAF/MEK/ERK信号传导途径诱导凋亡和G2/M期阻滞。C0818以蛋白酶体依赖性途径促进Hsp90客户蛋白的降解,包括C-Raf、P-C-Raf、Erk、P-ERK、MEK、P-MEK、AKT、P-AKT和RAS。此外,C0818增强了线粒体和死亡受体的凋亡通路,并促进Bax上调、Bcl2下调、caspase-8激活以及caspase-3、-7、-9和PARP的裂解。C0818诱导的线粒体功能障碍,包括MMP的丧失,产生过多的ROS和能量供应的中断,在抑制C0818处理后HCC细胞的生长和增殖中有重要作用。此外,C0818可以通过抑制NF-κB、P38、ERK和mTOR信号通路来抑制SASP。我们的数据表明,C0818在HCC的治疗以及消除HCC衰老细胞和抑制HCC进展方面可能是一种有前景的靶向Hsp90的疗法。