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背景及目的:子宫内膜癌是发生于女性生殖系统中的上皮性恶性肿瘤,全球每年有接近20万的新发病例,已经成为仅次于卵巢癌和宫颈癌的第三大常见妇科恶性肿瘤。目前子宫内膜癌的病因尚不清楚,缺乏有效治疗手段。中药具有广谱抗癌性、副作用小、降低复发等优势,寻找有效的天然药物为子宫内膜癌的治疗提供了新的研究方向。淫羊藿素有广泛的药理学活性,尤其具有显著的抗肿瘤活性。FOX蛋白是高度保守的转录因子超家族,在上皮细胞分化、肿瘤转移和血管形成、细胞周期调控等过程中发挥重要作用,FOXC1是FOX家族重要成员。据文献报道,FOXC1在子宫内膜癌中异常表达,并可能在子宫内膜癌的迁移和侵袭中起作用,然而对此的机制研究尚无报道。O-Glc NAc糖基化是一种常见的翻译后修饰,是尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-Glc NAc)与蛋白的丝/苏氨酸残基的羟基相连,该过程受到两种关键酶的动态调节,O-Glc NAc Transferase(OGT)和O-Glc NAcase(OGA)分别参与O-Glc NAc连接和移除。据报道,在子宫内膜癌中,高水平的O-Glc NAcylation促进细胞增殖、迁移和侵袭。癌症的发生发展常伴随着蛋白质的O-Glc NAc修饰,但转录因子FOXC1的O-Glc NAc修饰情况未见报道。本研究旨在探究淫羊藿素是否可通过影响转录因子FOXC1的O-Glc NAc修饰来调控子宫内膜癌的进程。方法:1、通过免疫组化实验检测FOXC1在子宫内膜癌中的表达。2、在子宫内膜癌细胞RL95-2和ishikawa中转染si FOXC1,通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验检测FOXC1对细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力的影响。3、探究O-Glc NAc修饰对FOXC1蛋白表达的影响。(1)在子宫内膜癌细胞RL95-2和ishikawa中转染si OGT,检测FOXC1蛋白的变化。(2)在子宫内膜癌细胞RL95-2和ishikawa中转染over FOXC1质粒,24h后免疫共沉淀检测FOXC1与O-Glc NAc之间的互作关系。(3)分别用OGA抑制剂Thiamet G(200n M)和OGT抑制剂OSMI(100μM)处理子宫内膜癌细胞RL95-2和ishikawa细胞48h,通过Western Blot实验检测Thiamet G和OSMI对O-Glc NAc修饰水平和FOXC1的变化;(4)构建O-Glc NAc糖基化原核反应体系,使用p ET28a-FOXC1质粒与p Receiver-B10-OGT质粒共转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,使用卡那和氨苄双抗性筛选共转化成功的单克隆菌落。蛋白质印迹检测FOXC1和OGT的表达情况后,使用O-Glc NAc抗体RL-2检测重组FOXC1蛋白的O-Glc NAc修饰水平。使用His标签蛋白纯化试剂盒对重组FOXC1进行纯化,蛋白质印迹检测纯化后的FOXC1蛋白的O-Glc NAc修饰水平。4、淫羊藿素处理子宫内膜癌RL95-2和ishikawa细胞24h,分别通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验检测淫羊藿素对细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞仪检测淫羊藿素对细胞周期进程的影响;5、淫羊藿素处理子宫内膜癌RL95-2和ishikawa细胞24h,蛋白质印迹检测对细胞内O-Glc NAc修饰水平的影响。6、淫羊藿素处理子宫内膜癌RL95-2和ishikawa细胞24h,Western Blot实验检测FOXC1蛋白表达的变化,在子宫内膜癌RL95-2和ishikawa细胞中转染over FOXC1质粒,免疫共沉淀实验检测淫羊藿素对FOXC1的O-Glc NAc修饰的影响。7、裸鼠体内成瘤实验检测淫羊藿素对子宫内膜癌的作用;提取瘤体蛋白,Western Blot实验检测对照组和加药组FOXC1蛋白表达和O-Glc NAc修饰水平的差异。结果:1、对临床样本的免疫组化实验表明,与正常组织相比,FOXC1在子宫内膜癌组织中的表达显著升高。2、下调FOXC1抑制子宫内膜癌RL95-2、ishikawa细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭的能力。3、FOXC1在真核细胞中和原核重组表达体系中均受到O-Glc NAc修饰。4、淫羊藿素可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力;并将细胞周期阻滞在S期。5、淫羊藿素在子宫内膜癌RL95-2、ishikawa细胞中降低FOXC1的表达;同时降低细胞的O-Glc NAc修饰水平。6、淫羊藿素影响FOXC1上的O-Glc NAc修饰。7、淫羊藿素在体内抑制子宫内膜癌细胞的生长以及瘤体中FOXC1蛋白和O-Glc NAc的表达。结论:1、FOXC1在子宫内膜癌组织中过度表达并影响子宫内膜癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力。2、淫羊藿素抑制子宫内膜癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,且将细胞周期阻滞在S期。3、淫羊藿素降低细胞内O-Glc NAc修饰,并且可能通过影响FOXC1的O-Glc NAc修饰进一步影响FOXC1的蛋白稳定性。