旋毛虫与A549肺癌细胞相关抗原筛选及其抗体抗肿瘤效应的研究

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本试验首先应用ELISA和Western blotting方法,鉴定旋毛虫和A549肺癌细胞间是否存在相关抗原,随后通过对旋毛虫cDNA表达文库的免疫筛选获取旋毛虫和A549肺癌细胞相关抗原基因。旋毛虫的相关抗原基因经原核表达后,表达获得的重组蛋白经乳化免疫动物制备获得抗体血清,最后通过荷瘤裸鼠的治疗试验评价旋毛虫相关抗原抗血清对A549肺癌肿瘤的治疗效果。旋毛虫与A549细胞相关抗原的鉴定首先制备旋毛虫虫体的可溶性抗原,取旋毛虫保种昆明鼠,断颈处死,并利用常规消化法收集旋毛虫肌幼虫,虫体经纯化,超声破碎,离心后,取上清加佐剂乳化后免疫小鼠制备旋毛虫可溶性蛋白的抗体血清。复苏A549肺癌细胞,同样免疫制备可溶性蛋白抗原的抗体血清。ELISA鉴定旋毛虫可溶性蛋白与A549细胞可溶性蛋白血清抗体及A549细胞可溶性抗原与旋毛虫可溶性蛋白血清抗体间的抗原抗体免疫交叉反应,结果显示旋毛虫与A549细胞之间存在免疫交叉反应。Western-blotting鉴定旋毛虫多克隆抗体血清与A549细胞间的抗原交叉,获得3条特异性条带,且A549细胞相关抗原蛋白的分子量大小分别为9Kda,27Kda和54Kda。旋毛虫与A549肺癌细胞相关抗原基因的筛选利用A549细胞的抗血清筛选旋毛虫的cDNA表达文库,经过初筛和复筛后,挑取阳性噬菌斑,经PCR扩增,测序,并进行Blast比对和生物信息学分析,从筛选结果中选取5个相关抗原蛋白基因(Tsp05904, Tsp10855, Tsp06172, Tsp08404, Tsp05091)进行下一步试验。旋毛虫与A549细胞相关抗原基因的原核表达根据Blast比对获取的旋毛虫基因序列,设计特异性引物。提取旋毛虫的mRNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段,并将目的基因克隆到pET-28a载体,并转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后。Ni纯化重组蛋白,免疫小鼠制备获得旋毛虫与A549细胞相关抗原重组蛋白的高免血清。旋毛虫相关抗原蛋白抗血清对荷有A549实体瘤的裸鼠治疗效果的观察复苏A549肺癌细胞,接种裸鼠,建立A549肺癌肿瘤模型,在荷瘤20d后,对小鼠进行治疗,并观察记录小鼠的精神状态及肿瘤的生长情况。治疗2周后处死小鼠,测量小鼠肿瘤的重量,体积,计算抑瘤率。结果显示,实验组的抑瘤率,分别是53.71%,64.77%,52.39%,40.93%,54.63%(Tsp05904, Tsp10855,Tsp06172, Tsp08404, Tsp05091)。均高于旋毛虫全蛋白抗体血清对照组(36.44%),及阴性对照组。本试验为研究旋毛虫相关抗原抗体抗A549肺癌肿瘤的深入研究奠定了基础,为研发旋毛虫抗肿瘤制剂提供实验依据。
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