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目的:
假性维生素D缺乏性佝偻病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets，PDDR)，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，系编码250HD31α羟化酶的CYP2781基因突变所致，目前基因突变已发现近四十种，本组前期的研究首次在5名中国PDDR患者中发现了4个新突变，但这几个突变对25OHD31α羟化酶的功能影响尚未证实。因此本实验的主要目的是在构建CYP27B1体外过表达体系的基础上，研究我组新发现的2个错义突变G57V和L333F对250HD31α羟化酶活性的影响，进而加深临床医生对于突变型和临床表型关系的认识。
方法:
1.通过定点诱变将突变引入连接在质粒载体pCMVXL5上的CYP27B1cDNA，构建突变型CYP2781基因G57V和L333F，并在体外大量扩增，得到大量的载有野生型和突变型基因的质粒DNA。
2.通过阳离子脂质体法转染载有野生型和突变型基因的质粒至293T人胚肾细胞，构建CYP27B1野生型和突变型基因的体外过表达体系
3.转染36小时后，向细胞培养液中加入不同浓度的底物25OHD3，然后放入CO2培养箱继续培养，使野生型和突变型酶在适当条件下进行体外羟化反应:
4.收集细胞培养液，经过提取和C18柱纯化，用放免法对不同类型的细胞培养液进行250HD3和1，25(OH)2D3浓度的检测，通过SPSS析因分析，比较突变型与野生型不同基因型之间是否存在显著差异
5.收集完细胞培养液后将细胞提取总蛋白，通过western blot检测验证野生型和突变型的蛋白在体外是否有表达及表达水平是否一致。
结果:
1.CYP2781野生型和突变型基因在293T细胞体外过表达体系中均有所表达，而且表达水平一致。
2.体外过表达的野生型和突变型CYP2781均具酶活性，可以产生1，25(OH)2D3并被检测到，突变型CYP2781组1，25(OH)2D3水平显著减低，其中G57V和L333F的酶活性分别为野生型的56.8％和70.75％。
结论:本实验成功构建了1α羟化酶(CYP2781)在293T人胚肾细胞中的体外过表达模型，并以此为基础，对于在中国人群中首次发现的导致PDDR的两个错义突变进行了功能研究。结果显示:突变型G57V和L333F的酶活性较野生型显著减低，且与患者的临床表型具有一定联系。
假性维生素D缺乏性佝偻病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets，PDDR)，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，系编码250HD31α羟化酶的CYP2781基因突变所致，目前基因突变已发现近四十种，本组前期的研究首次在5名中国PDDR患者中发现了4个新突变，但这几个突变对25OHD31α羟化酶的功能影响尚未证实。因此本实验的主要目的是在构建CYP27B1体外过表达体系的基础上，研究我组新发现的2个错义突变G57V和L333F对250HD31α羟化酶活性的影响，进而加深临床医生对于突变型和临床表型关系的认识。
方法:
1.通过定点诱变将突变引入连接在质粒载体pCMVXL5上的CYP27B1cDNA，构建突变型CYP2781基因G57V和L333F，并在体外大量扩增，得到大量的载有野生型和突变型基因的质粒DNA。
2.通过阳离子脂质体法转染载有野生型和突变型基因的质粒至293T人胚肾细胞，构建CYP27B1野生型和突变型基因的体外过表达体系
3.转染36小时后，向细胞培养液中加入不同浓度的底物25OHD3，然后放入CO2培养箱继续培养，使野生型和突变型酶在适当条件下进行体外羟化反应:
4.收集细胞培养液，经过提取和C18柱纯化，用放免法对不同类型的细胞培养液进行250HD3和1，25(OH)2D3浓度的检测，通过SPSS析因分析，比较突变型与野生型不同基因型之间是否存在显著差异
5.收集完细胞培养液后将细胞提取总蛋白，通过western blot检测验证野生型和突变型的蛋白在体外是否有表达及表达水平是否一致。
结果:
1.CYP2781野生型和突变型基因在293T细胞体外过表达体系中均有所表达，而且表达水平一致。
2.体外过表达的野生型和突变型CYP2781均具酶活性，可以产生1，25(OH)2D3并被检测到，突变型CYP2781组1，25(OH)2D3水平显著减低，其中G57V和L333F的酶活性分别为野生型的56.8％和70.75％。
结论:本实验成功构建了1α羟化酶(CYP2781)在293T人胚肾细胞中的体外过表达模型，并以此为基础，对于在中国人群中首次发现的导致PDDR的两个错义突变进行了功能研究。结果显示:突变型G57V和L333F的酶活性较野生型显著减低，且与患者的临床表型具有一定联系。