背景及目的支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿、尤其是小早产儿呼吸系统常见疾病,是影响新生儿远期预后的3大高危因素之一。BPD主要由围生期感染、机械通气、高氧暴露等引起。近年来,随着新生儿重症监护技术的提高,早产儿尤其是极低出生体重儿存活率增加,BPD等早产儿相关疾病发病率也有所上升,超低出生体重儿中BPD发生率达到30%。BPD患儿不仅其肺功能受到严重损害,其体格发育以及神经系统发育也受很大影响,造成家庭和社会的沉重负担。因此,迫切需要了解BPD的发生机制从而寻求有效的防治措施减少并减轻早产儿BPD,最终改善早产儿远期生存质量。研究发现,血管生长与肺泡发育密切相关,抑制血管的正常生长直接导致肺泡化受阻,Abman由此提出肺发育的“血管假说”,肺血管发育紊乱及肺泡化阻滞是BPD发生发展的关键事件。目前认为肺血管发育和肺泡化与众多因素有关,包括基因表达调控,生长因子的表达,细胞外基质的产生和成熟,以及呼吸运动的协同作用等。生长因子被认为在肺血管发育和肺泡化中起关键作用,在晚期肺发育以及BPD发展中,多种生长因子信号被发现。胎盘生长因子(Placental growth factor,P1GF)是一种分泌型同型二聚体糖蛋白,相对分子质量为29 × 103,是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)家族中的一员。P1GF主要表达于胎盘、甲状腺、肺等组织,与血管内皮生长因子受体 1(Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1,也即 Flt-1)结合而发挥调节血管发育等作用。P1GF只参与病理状态下的新生血管形成,而对正常血管发育影响不大。P1GF可引起白细胞浸润,肿瘤生长,基质细胞迁移,缺血组织血管再通;P1GF可趋化单核细胞和巨噬细胞,并激活巨噬细胞释放炎症因子,P1GF表达缺陷的小鼠组织内巨噬细胞浸润减少,炎症反应减轻;阻断P1GF的受体Flt-1可以有效抑制动脉粥样硬化、关节炎等的血管炎症反应;另外,抑制P1GF活性可降低肝硬化小鼠纤维化和炎症的严重性;肿瘤动物模型研究中,用抗P1GF单克隆抗体治疗能抑制肿瘤生长、血管新生及巨噬细胞聚集,而不影响健康组织。正常情况下,P1GF及受体Flt-1在人类妊娠期的后三个月表达增加,即在肺发育的囊泡肺泡期及泡状肺泡期表达增高,而在肺间隔形成及肺泡化过程中迅速下调。据此,我们推测晚期发育肺在受损后过度表达P1GF,P1GF促进肺血管内皮细胞激活、增殖及迁移,导致肺血管紊乱,同时激活巨噬细胞释放炎症因子,肺泡上皮细胞损伤、转化受阻,肺泡化停止,最后导致BPD的发生;同时,我们假定,在早产儿BPD动物模型中,抗P1GF单克隆抗体在肺损伤高P1GF介导的肺血管异常增殖中可能发挥阻断作用。第一部分 PIGF过表达对高氧暴露损伤胚肺上皮细胞模型的影响目的:分析高氧处理及过表达胎盘生长因子(Placental growth factor,P1GF)P1GF对肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cells,PMEC)和肺微血管上皮细胞(Type Ⅱ alveolar epithelial cell,AEC-Ⅱ)的影响。方法:1.通过基因合成得到P1GF过表达腺病毒质粒和菌株。P1GF过表达腺病毒质粒以及包装质粒转染293a细胞,收集P1和P2代腺病毒液,超速离心法纯化浓缩,并通过进行滴度测定。2.阴性对照空病毒命名为Ad-NC,表达P1GF的腺病毒命名为Ad-P1GF。高氧环境中培养PMEC和AEC-Ⅱ细胞构建高氧模型。通过感染PMEC和AEC-Ⅱ细胞P1GF过表达腺病毒获得P1GF腺病毒组。以正常培养的细胞和腺病毒感染(Ad-NC)的细胞作为对照。3.免疫荧光检测P1GF在各组细胞中的表达情况;ELISA检测ICAM-1/CD54和VEGFR1在各组细胞中的表达情况;Transwell检测各组细胞迁移能力;4.qPCR 和 western blot 检测各组细胞内 E-cadherin、COL1A1、FN 和 α-SMA的表达变化。结果:1.经过检测,病毒滴度为2×1010 PFU/ml。免疫荧光结果表明,高氧处理和P1GF过表达腺病毒感染均可以增加PMEC和AEC-Ⅱ细胞内P1GF的表达水平。结果说明,模型构建成功,可以用于后续的实验。2.ELISA结果表明,高氧处理和P1GF过表达可以诱导ICAM-1/CD54和VEGFR1的高表达。Transwell检测结果表明,高氧处理和P1GF过表达可以提高PMEC和AEC-Ⅱ细胞的迁移能力。3.qPCR和western blot检测结果表明高氧处理和P1GF过表达均可以明显降低PMECA和AEC-Ⅱ细胞中上皮间质转化相关蛋白E-cadherinmRNA和蛋白水平的表达,增加纤维化标志物COL1A1、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平的表达。结论:高氧处理和P1GF过表达可以增强PMECA和AEC-Ⅱ细胞的血管形成能力、迁移能力,诱导细胞出现上皮间质转化和纤维化。第二部分 抗P1GF单克隆抗体对高氧诱导早产儿支气管肺发育不良大鼠模型的影响目的:分析抗P1GF抗体对新生大鼠高氧性肺损伤的影响,以及明确过表达P1GF是否可以引起新生大鼠的肺损伤。方法:1.根据蛋白的氨基酸序列,优化和合成P1GF序列,并构建至原核表达载体PGEX-6p-1。将PGEX-6p-1-P1GF阳性质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3)。SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况。利用高亲和性NI树脂纯化P1GF蛋白,尿素复性。将获得的蛋白免疫新西兰大白兔。最后一次免疫后第14天,采血,纯化抗体。2.将新生大鼠随机分配入空气组、空气+腺病毒组、空气+空载腺病毒组、高氧模型组和高氧+抗P1GF抗体组。3.HE染色观察肺组织病理变化;透射电镜电镜观察肺细胞超微结构。4.qPCR和western blot检测P1GF及受体Flt-1基因的表达。5.ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6水平;制作肺泡灌洗液的细胞悬液做涂片,苏木素染色后计数细胞数量;免疫组化检测CD34的变化。结果:1.P1GF的多克隆抗体的效价为1:243000,符合后续实验的要求。造模后,各组乳大鼠未见异常,母鼠生长情况良好。腺病毒和抗P1GF抗体干预后也未见动物有异常反应。至实验结束,无动物异常死亡。2.HE染色和透射电镜的结果显示,注射P1GF过表达腺病毒和高氧均可以引起新生大鼠出现明显的肺损伤,注射抗P1GF抗体可以明显改善高氧引起的肺组织损伤。3.qPCR和western blot结果表明,注射P1GF过表达腺病毒可以明显增加肺组织中P1GF及受体Flt-1 mRNA和蛋白的表达水平;与空气组相比,高氧组和高氧+抗P1GF抗体组的P1GF及受体Flt-1蛋白的表达水平均明显升高。4.ELISA结果表明,注射P1GF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平;与高氧组相比,高氧+抗体组肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显降低。苏木素染色结果表明,注射P1GF过表达腺病毒和高氧均可以降低单核细胞和中性粒细胞的数量;与高氧组相比,高氧+抗体组的单核细胞和中性粒细胞没有明显的变化。免疫组化结果表明,注射P1GF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加CD34的表达;与高氧组相比,高氧+抗体组CD34的表达明显降低。结论:1.高氧可以诱导新生大鼠肺组织中P1GF及受体Flt-1 mRNA和蛋白表达水平的上调;高氧组新生大鼠肺损伤加重,肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显升高,CD34的表达水平明显增多;注射P1GF过表达的慢病毒的新生大鼠肺组织也出现和高氧组相似的变化。P1GF在高氧诱导的新生大鼠的肺组织损伤中发挥调控作用。2.阻断P1GF的作用可以明显改善肺组织的损伤,降低肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6的表达水平以及肺组织中CD34的表达水平。该结果将为临床寻求防治早产儿支气管肺发育不良提供新的思路,具有重要的转化医学意义。第三部分 脐血PIGF水平与BPD的关系目的:比较BPD组与非BPD组之间血清P1GF水平。探讨脐血P1GF作为生物学指标预测BPD的价值。方法:1.前瞻性队列研究,拟对2015年7月至2017年12月我院分娩,且出生体重≤1500克的早产儿为研究对象。排除先天性心脏病患儿、出生胎龄≤22周、矫正胎龄36周前死亡的患儿以及脐血标本缺失的患儿。BPD定义为用氧至少28天,矫正胎龄36周时评估其严重程度[2],经皮氧饱和度小于88%作为用氧指征,维持经皮氧饱和度在88～95%之间。2.收集拟定研究对象脐血标本;采用RayBio(?)Human P1GF ELISA Kit Protocol,Elsia 测定脐血 P1GF 水平。3.SAS 9.2统计软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(Z±s)(正态分布)或中位数(Median(P75-P25))(非正态分布)表示,两组间比较采用t检验和Wilcoxon检验;计算资料采用率表示,两组间比较采用卡方检验。变量呈正态分布采用Pearson相关性分析,变量呈非正态分布采用Spearman相关分析。BPD危险因素用二分类Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.2015年7月至2017年12月期间出生体重≤1500克早产儿共124例,排除放弃、转院及死亡后,共纳入111例早产儿,其中BPD组共30例早产儿,非BPD组共81例早产儿。2.相比非BPD组,BPD组有更低的出生体重、更小的胎龄、需要药物治疗的PDA更多、更多的肺表面活性物质和咖啡因应用率以及更高的败血症发生率,此外,BPD组机械通气超过1周更频繁,BPD组住院时间更长,脐血P1GF水平(pg/ml)在BPD组较非BPD组更高(18.4±6.9 vs 6.1±5.3,P<0.00001)。出生胎龄与脐血P1GF 水平呈线性相关(R=-0.25,P=0.007)。3.在矫正影响BPD的混杂因素后,Logistic回归分析提示脐血P1GF浓度与BPD 发生明显相关(OR=1.286,95%CI(1.132,1.460),P=0.0001)。当脐血P1GF≥9.854pg/ml时,其诊断敏感性、特异性分别为93.3%、71.5%,AUC值为0.9177。结论:脐血P1GF水平与BPD密切相关,脐血≥9.854pg/ml作为BPD早期预测指标,具有较高的预测价值。