非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性、高度接触性传染病。自2018年8月传入中国以来给养猪业带来了巨大的经济损失,然而到目前为止尚无有效的疫苗或药物用于ASFV的临床防治。先前的研究表明巨噬细胞是ASFV的主要入侵和复制场所,其基因组中有两个开放阅读框编码E165R和EP152R,是保证ASFV在猪巨噬细胞正常复制的必需基因,可作为重要的抗病毒靶点。本研究聚焦于pE165R和pEP152R的结构和功能研究,主要内容如下:1.阐明了ASFV pE165R识别底物的结构基础和催化机制,通过与宿主同源蛋白的比较,指导并开发了针对ASFV dUTPase的特异性抑制剂。E165R编码脱氧尿苷焦磷酸酶dUTPase,保证了ASFV在猪巨噬细胞等静止细胞中正常复制。因此,ASFV dUTPase可以作为一个很好的药物设计靶标。本文解析了ASFV dUTPase野生型结构及与产物或底物的复合物结构。通过分析蛋白与底物的互作模式,详细揭示了ASFV dUTPase非经典的双亚基活性中心组装方式和催化机制,并通过生化实验确定了催化中心的关键氨基酸,这为抑制剂设计提供了理论指导。同时为了防止抑制剂对宿主猪可能的细胞毒性,我们还解析了猪脱氧尿苷焦磷酸酶swine dUTPase结构,通过两种dUTPases之间的结构比较,发现:（i）二者组装活性中心的方式差异明显;（ii）参与底物催化的关键氨基酸存在差异;（iii）利用相似的?发夹结构来识别和固定底物;（iv）ASFV dUTPase活性中心的体积更大;（v）二者活性中心的疏水性分布相同;（vi）活性中心的静电分布有明显差异。这些异同为特异性抑制剂提供了理论指导。最后,我们设计了特异性抑制剂并测试其对swine dUTPase和ASFV dUTPase的抑制效果,结果显示抑制剂1可以选择性抑制ASFV dUTPase的活性。总之,我们提供了有价值的结构信息指导ASFV dUTPase特异性抑制剂开发。2.揭示了ASFV pEP152R对宿主细胞翻译、周期、免疫和内质网应激等内环境的调控作用,为理解pEP152R如何促进ASFV复制提供了思路。共聚焦实验结果证明pEP152R是一种定位于内质网的膜蛋白。pEP152R可诱导内质网肿胀,破坏内质网稳态,触发内质网应激和未折叠蛋白反应,通过激活PERK/e IF2α通路广泛抑制宿主蛋白的合成。除了对细胞翻译的影响,pEP152R还可以抑制先天免疫因子的表达,如ISG15,ISG54,ISG56和IFN-β。此外,pEP152R能使细胞周期停滞在G0/G1期,这将减少细胞增殖对细胞内能量的消耗。病毒水平实验表明,干扰EP152R的表达显著影响了ASFV的复制。同时,PERK是一个有效的抗病毒药物作用靶点,GSK2656157具有成为抗ASFV药物的潜力。总之,我们揭示了ASFV pEP152R的新功能,为理解pEP152R如何促进ASFV复制提供了思路。综上,本研究以ASFV两种影响病毒复制的关键蛋白pE165R和pEP152R为研究对象,首先解析了pE165R三维结构,阐明了新颖的双亚基活性中心组装方式和催化机制,并基于病毒与宿主dUTPases差异设计了特异性抑制剂。其次,我们发现了pEP152R对内质网稳态的影响,揭示了激活内质网应激抑制宿主翻译的分子机制。同时明确了pEP152R在感染过程中对宿主先天免疫、细胞周期的调控作用,提高了对ASFV致病机制的理解。总体而言,本课题从影响ASFV复制的必需蛋白入手,利用结构生物学和病毒学等手段深入阐明了pE165R和pEP152R对宿主内环境的调节作用,为基于抗病毒靶点开发药物提供策略。