番木瓜是番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属(Carica L.)植物,是热带、亚热带重要果树之一。番木瓜果实属呼吸跃变型,在18℃以上,采后果实迅速成熟、软化。番木瓜对低温敏感,不能冷藏运输,因此在运输和储藏中的损失是巨大的,高达23.7%。近年来,随着分子生物学的发展,延缓果实衰老的研究转向采用基因工程培育耐储运新品种上。番木瓜果实成熟软化相关基因克隆及其遗传转化的研究比较少,没有见到耐储运新品种商业化生产的报道。为了解番木瓜果实成熟的分子机理,挖掘更多更有效的果实抗软化基因,以番木瓜不同成熟度果实为试材,采用cDNA-AFLP技术分析了果实成熟基因差异表达情况,并利用RACE技术克隆了差异表达基因。果胶裂解酶(Pectate lyase, PL)与β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-Gal)都参与了果胶物质的降解过程,与果实成熟软化密切相关。克隆了番木瓜果胶裂解酶基因,构建了PL反义植物表达载体以及PL与β-Gal双价反义植物表达载体,建立了体胚发生系统,并通过农杆菌介导法将两个载体分别转化番木瓜,获得了抗性体胚。本研究的主要结果如下:1番木瓜不同成熟度果实cDNA-AFLP分析利用cDNA-AFLP技术对破色期和半黄期番木瓜果实进行基因差异表达分析,获得了50个T DFs,其中28个与Genbank数据库中的功能基因同源,5个与未知功能的基因同源,17个未找到同源基因。经生物信息学分析,这28个与已知功能基因同源的TDFs分别参与了果实成熟过程中基因表达调控、DNA与蛋白质合成及运输、蛋白质降解、能量代谢、营养物质代谢和植物逆境胁迫反应的过程。11个与基因表达调控有关的差异片段中,7个与信号转导有关,3个为转录因子,1个与转录后调控有关。2番木瓜果实成熟差异表达基因及Actin基因的克隆与分析采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了5个果实成熟差异表达基因和一个肌动蛋白基因,并用半定量RT-PCR分析了它们在不同成熟度番木瓜果实中的表达量差异。克隆了番木瓜过氧化物酶基因,CpPOD全长cDNA为1124 bp。序列分析发现,没有起始密码子,可能是测序错误或碱基缺失造成的。不同成熟度CpPOD基因表达量分析表明,绿色期表达量很低,破色期表达量非常大,半黄和全黄时表达量有所下降。克隆了番木瓜MYB转录因子,CpMYB全长cDNA为1507 bp,含有一个879 bp的开放阅读框,编码292个氨基酸。基因表达分析表明,CpMYB基因随着番木瓜成熟表达量逐渐增加,衰老期又开始降低。克隆了番木瓜GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因,CpGMP全长cDNA为1544 bp。以基因组DNA为模板扩增ORF长1775 bp,含有4个外显子,3个内含子;cDNA为模板扩增ORF长1096 bp,编码361个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,CpGMP基因随着番木瓜果实成熟表达量逐渐增加,软化时又逐渐降低。克隆了番木瓜20S蛋白酶体α亚基6蛋白基因,CpPAA1全长cDNA为1025 bp,含有一个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸。表达量分析发现,CpPAA1基因随着番木瓜成熟表达量逐渐增加,衰老期又开始降低。克隆了番木瓜植物类受体蛋白激酶基因3’端序列,cDNA长924 bp。表达量分析表明,绿色期表达量最高,然后随着果实成熟和衰老表达量逐渐降低。克隆了番木瓜肌动蛋白基因,CpActin全长cDNA为1533 bp,含有一个1134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸。3番木瓜果实果胶裂解酶基因克隆及反义植物表达载体的构建采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实果胶裂解酶基因的完整3’端和部分5’端序列。然后,根据本实验室已经获得的PL基因5’端DNA序列及作者得到的3’端序列设计上、下游引物,以番木瓜基因组DNA为模板扩增得到了PL基因的开放阅读框。该序列长1464 bp,含有4个外显子,3个内含子,编码385个氨基酸。然后构建了PL基因反义植物表达载体pBP,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。4番木瓜PL和β-Gal基因的双价植物反义表达载体的构建在番木瓜PL和β-Gal基因序列的基础上,设计特异引物,分别扩增保守区序列,将其分别反向插入植物表达载体pCAMBIA1301-35S-GUS-Nos的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pCP和pCG。然后用两种不同的方法将带有完整启动子和终止子的PL和β-Gal基因引入pCAMBIA2301中,获得了PL和β-Gal的双价植物反义表达载体pCPG,并对两种方法进行了比较。5番木瓜体胚发生系统的建立及遗传转化以番木瓜幼胚为外植体,研究不同激素配比对胚性愈伤组织及体胚诱导的影响。结果表明,胚性愈伤组织诱导的最适培养基为改良MS+10 mg/L 2,4-D +2 mg/L KT +0.5 mg/L BA +30 g/L蔗糖+400 mg/L谷氨酰胺,体胚诱导最适培养基为改良MS+10 mg/L 2,4-D +2 mg/L KT+30 g/L蔗糖+400 mg/L谷氨酰胺。利用农杆菌介导法将构建好的PL基因反义表达载体和PL与β-Gal基因双价反义表达载体分别转化番木瓜,获得了抗性体胚。