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目的：本实验室前期实验发现：采用固定化金属螫合亲和层析(ImmobilizedMetalAffinityChromatography，IMAC)，从血浆蛋白分离Cohn氏法组分Ⅳ(CohnFractionⅣ，CFⅣ)纯化蛋白C(ProteinC，PC)过程中，以咪唑(Imidazole)缓冲液进行阶段洗脱时，在低浓度(0.008mol/L)和高浓度(0.040mol/L)的咪唑缓冲液作用下，蛋白洗脱峰分别具有较高的PC抗原性和PC活性，而在中间浓度(0.015mol/L)的咪唑缓冲液作用下，蛋白洗脱峰虽具有较高的PC抗原性，但PC活性较低。从该现象推测，CFⅣ中可能含有性质差异较大的PC活性成分，这在国内外未曾见报道。本实验旨在探明其原因，为PC制品的制备和应用提供理论基础。
方法：(1)用离子交换层析初步纯化CFⅣ中的PC后，①重复原来的IMAC实验；②设计新的IMAC洗脱方案：采用0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.300mol/L的咪唑洗脱浓度。
(2)用发色底物法检测PC活性。
(3)用WesternBlot方法证明PC特异性。
(4)用毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophrosis，CZE）分析前后两种IMAC洗脱方案中的各洗脱峰。
(5)用免疫亲和层析(ImmuneAffinityChromatography，IAC)纯化IMAC中PC差异显著的洗脱峰。
(6)用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术分析PC差异成分，获得质谱图，并从生物信息学角度分析原因。
结果：(1)PC活性检测显示：①原来的IMAC实验中，0.008mol/L、0.015mol/L、0.040mol/L咪唑缓冲液洗脱的PC活性分别为（75.941±3.010）％、（5.592±1.410）%、（42.334±2.821）%；0.015mol/L咪唑缓冲液洗脱的PC活性与0.008mol/L和0.040mol/L咪唑缓冲液洗脱的PC活性进行t检验，P值均小于0.05，有显著性差异。②新的IMAC洗脱方案中，0.008mol/L、0.040mol/L、0.150mol/L和0.300mol/L的咪唑缓冲液洗脱的PC活性分别为（73.411±2.076）%、（54.694±1.692）%、(31.610±1.118)%和(30.557±2.553)%；0.015mol/L咪唑缓冲液洗脱的PC活性与0.300mol/L的咪唑缓冲液洗脱的PC活性进行t检验，P值小于0.05，有显著性差异。
(2)WesternBlot结果显示：①用0.015mol/L咪唑缓冲液洗脱的蛋白洗脱峰仅在52KDa处有一条蛋白曝光带(smallPC，sPC)；其他浓度的咪唑缓冲液洗脱的蛋白洗脱峰在62KDa处有一条蛋白曝光带(bigPC，bPC)；②在110KDa处，CFIV来源的所有样品都有一条蛋白曝光带。
(3)CZE结果显示：0.015mol/L咪唑缓冲液洗脱液中的PC在迁移时间为(10.467±0.016)min和（11.333±0.009）min时出峰，在(10.667±0.024)min和（16.167±0.012）min时不出峰。0.300mol/L咪唑缓冲液洗脱液中的PC的在上述迁移时间的出峰情况与前者相反。
(4)0.015mol/L咪唑缓冲液洗物经IAC纯化，得到以sPC为主要成分的浓缩物，PC活性为（41.903±1.900）%；0.300mol/L咪唑缓冲液洗脱物经IAC纯化，得到以bPC为主要成分的浓缩物，PC活性为(1238.523±3.996)%。两样品PC活性进行t检验，P值小于0.05，具有显著性差异。
(5)HPLC-MS/MS显示：0.015mol/L咪唑缓冲液洗脱物经IAC纯化后的样品为PC，Mascot积分为379;0.300mol/L咪唑缓冲液洗脱物经IAC纯化后的样品同样为PC，Mascot积分为809。
(6)生物信息学结果显示：①sPC与bPC的PC匹配肽相比较，有4个相同肽段、1个较短肽段和3个缺失肽段；110KDa对曝光的蛋白条带具有6个PC匹配肽。②sPC的PC匹配肽中含有3个组氨酸和4个色氨酸，bPC的PC匹配肽中分别含有6个组氨酸和6个色氨酸。
结论：(1)CFⅣ中存在活性差异较大的两种PC成分。大分子量的bPC活性高，小分子量的sPC活性低。
(2)sPC与bPC中肽段的差异，是两种PC成分具有不同活性的原因。
(3)sPC与bPC中关键氨基酸数量的不同，是两种PC成分能被不同浓度的咪唑缓冲液先后竞争洗脱下来的原因。
(4)Cohn氏法组份Ⅳ中存在110KDa的包含蛋白C的另一种成分。