论文部分内容阅读
目的:糖尿病患者皮肤易受损伤,损伤后创面愈合延迟或不愈合。在糖尿病人群中足部溃疡的发生率为2%,糖尿病患者一生中的15%会罹患此并发症。糖尿病溃疡预后较差,3年生存率在50%左右。既往研究认为,糖尿病合并创面难愈的因素主要集中在以下几方面:①糖代谢紊乱及晚期糖基化终末产物增多;②微血管改变;③基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)在糖尿病患者致伤前后的表达异常;④表皮生长因子受体的改变;⑤表皮细胞增殖障碍。而目前基于以上机制用于治疗糖尿病溃疡的药物均未成功,仅有重组PDGF(recombinant platelet-derived growth factor)疗效较好。创面愈合过程中任何一个环节不协调或功能障碍均可导致创面愈合失控。目前关于糖尿病创面难愈的机制仍未阐明。Wnt细胞信号转导途径是调控细胞生长、发育和分化的关键途径。此信号途径中的关键因子β-catenin稳定性以及其在细胞内的位置受到一系列正性调节因子和负性调节因子的调控,其调控异常可导致Wnt信号通路的抑制或异常激活,从而产生基因表达、细胞黏连、发育方面等一系列异常,并与癌症发生、转移密切相关。Wnt信号途径与PGE2/EP2信号、EGF/EGFR/PI-3K/AKT以及钙粘蛋白E-cadherin信号调控途径之间存在较为复杂的crosstalk系统。最新的研究发现,Wnt以及β-catenin表达增强,表皮细胞的增殖、分化和迁移能力增强,且创面愈合加快;皮肤角质化细胞Wnt信号途径影响创伤后皮肤的厚度及色素沉着;Wnt信号途径参与保护高糖导致的血管内皮细胞的损伤;β-catenin调控异常可以促进或抑制细胞凋亡;Chun-LiangLin等报道,Wnt/β-catenin信号的上调能提高高糖抑制的肾系膜细胞的活性;高糖通过PI3K-Akt信号途径抑制内皮细胞迁移和增殖及血管发生改变,也能引起黏附分子E-cadherin的上调;我们的初步研究提示,经高糖处理的内皮祖细胞β-catenin、EGFR和周期素D1表达减弱。从这些间接资料推测出,糖尿病的创面难愈与Wnt/β-catenin信号通路功能紊乱有关。因而,本研究拟对此进行探讨。方法:1.糖尿病难愈创面大鼠模型的建立:①1型糖尿病大鼠模型的建立:选择3月龄体重范围为201～240g清洁级SD雄性大鼠,禁食12h后以50mg/kgSTZ(链脲佐菌素)液一次性腹腔注射,于注射后第1、3、14d对动物的血糖进行测定,注射3d后动物血糖浓度>16.65 mmol/L判定为1型糖尿病动物模型。②制作大鼠背部皮肤缺损:取上述人工复制的糖尿病大鼠60只和正常大鼠20只,以3 %戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔推注麻醉后,背部剃毛,常规消毒。在无菌条件下用特制打孔器在鼠背中部脊柱两侧各打一圆孔,深至皮下,直径1.8cm,创面面积为2.54 cm2。止血后以无菌纱布包扎,换药1次/天,单笼喂养,定量饮水与喂食。所有实验均在清洁级动物实验室完成;2.处理对照组与实验组:本实验分为正常组、糖尿病组、糖尿病+氯化锂组、糖尿病+EGF组,共四组,每组各20只大鼠,①正常组及糖尿病组,正常喂养,记录每日饮水量、进食量、尿量及体重变化;②糖尿病+氯化锂组,除同上处理外,自糖尿病大鼠背部皮肤缺损模型制作成功之日即给予1/20LD50氯化锂(灌胃给药,LD50:526mg/kg),1次/d;③糖尿病+EGF组,用无菌注射器抽取rhEGF10ug滴加在无菌纱布上并覆盖创面,凡士林纱布、无菌纱布及绷带包扎固定,每日以相同方法换药一次;④伤后3d、7d检测各组创面细菌学变化(每平方厘米创面菌落数的常用对数),以排除细菌因素对创面修复的延迟作用;3.观察背部创面愈合情况:①创面形态学描述:湿润度、颜色、分泌物、形状、创缘及50%创面愈合时间;②创面面积:伤后即刻及3、7、14 d用透明膜覆盖创面沿创缘画膜,剪膜,置分度值为0.1mg的分析天平称重换算成面积,并计算创面愈合率;③伤腔容积:伤后即刻及3、7 d用1 ml注射器向伤腔内滴注生理盐水,至液面与创缘皮肤相平为止,记录注入量;④组织病理学检查,伤后14 d取创面组织HE染色,以成纤维细胞增生、毛细血管增生、表皮增生为指标观察;4.检测β-catenin表达情况(多少强弱,分布区域):采用SP免疫组织化学方法。判定标准:在l0×20倍显微镜下随机观察10个视野,每个视野计数100个细胞,免疫组化阳性信号为棕黄色颗粒状,观察阳性信号的染色强度、部位并计算阳性细胞数。按照Maruyama等的方法,观察β-catenin在细胞膜、细胞质、细胞核三个部位的表达强度判断,细胞膜>70%阳性为正常表达,反之为表达缺失,细胞质或细胞核>10%阳性为异位表达,细胞膜正常表达视为β-catenin阴性,细胞膜表达缺失或出现异位表达视为β-catenin阳性。结果:1.动物模型的稳定性,对糖尿病大鼠血糖水平的监测显示,大鼠血糖水平一直维持在21.23-24.60mmol/L,致伤前后不同时间糖尿病各组间差异无显著意义,符合模型制作标准;2.正常组大鼠每日饮水量、进食量及尿量均较糖尿病三组大鼠少,体重增加变化较糖尿病组大鼠明显,差别有统计学意义;糖尿病各组大鼠无统计学差异;3.伤后观察各组大鼠创面,未见感染征象,伤后3d、7d检测各组创面细菌学变化,组间无统计学差异,排除细菌因素对创面修复的延迟作用;4.正常组、糖尿病+氯化锂组及糖尿病+EGF组大鼠创面干燥、红润,分泌物少,创缘形状不规则,收缩明显,正常组大鼠50%创面愈合时间为5.5d,糖尿病+氯化锂组为5.9d,糖尿病+EGF组为5.7d,此三组间无显著差异,均较糖尿病组明显缩短(P<0.05),至伤后14天,此三组创面大部分均已完全愈合;糖尿病组大鼠创面潮湿,呈暗红色,有少许分泌物,形状多为椭圆形,创面凹陷,皮肤收缩不明显,随着伤后时间延长,创面面积略有缩小,但其50%创面愈合时间约在伤后9天,至伤后14天,仍有6个创面未愈合;5.伤后第3、7、14d,正常组、糖尿病+氯化锂组及糖尿病+EGF组间,创面愈合率无显著差异,但均较糖尿病组高,差别有统计学意义;伤后第1d,四组间创面愈合率无显著差异;6.伤后第3、7d,正常组、糖尿病+氯化锂组及糖尿病+EGF组间,伤腔容积缩小无显著差异,但均较糖尿病组缩小明显(P<0.05);伤后第1d,四组间伤腔容积变化无显著差异;7.伤后14 d取创面组织HE染色,正常组、糖尿病+氯化锂组及糖尿病+EGF组,表皮增生并覆盖创面,肉芽组织趋于成熟,成纤维细胞较丰富,胶原致密、排列整齐,毛细血管与创面垂直,组间无显著差异;糖尿病组表皮不同程度增生,大部分未完全覆盖创面,肉芽组织疏松,新生表皮下毛细血管较多,少量炎性细胞浸润,与上三组差别明显;8.伤后第3、7、14d,正常组、糖尿病+氯化锂组及糖尿病+EGF组,β-catenin细胞膜着色相对减少,出现细胞质粗细不等,数量不一的棕黄色阳性颗粒着色,β-catenin阳性细胞率三组间无显著差异,但与糖尿病组比较,阳性细胞率高,差异显著,而糖尿病组大鼠创面β-catenin围绕细胞膜呈连续细线状棕黄色染色,阳性细胞数明显较少。结论:1.糖尿病大鼠创面,β-catenin阳性细胞率比正常大鼠创面低,提示糖尿病大鼠在创面愈合的过程中Wnt/β-catenin信号通路功能相对低下,存在Wnt/β-catenin信号通路功能紊乱;2.在Wnt/β-catenin信号通路促进剂的作用下,糖尿病大鼠创面,β-catenin阳性细胞率较糖尿病大鼠增高,创面愈合明显好转,表现在创面清洁,肉芽组织丰富,创面愈合率高,愈合时间缩短。并在理论上为糖尿病难愈创面的治疗提供一个新的途径;3.EGF能促进糖尿病创面愈合,Wnt/β-catenin信号通路可能参与其中。