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糖尿病是由内分泌和代谢失调导致的一种慢性疾病,主要临床表现是“三多一少”,并且血糖表现出异常升高。糖尿病还会导致一些并发症,如心脑血管疾病、肾脏疾病、眼部疾病、神经系统疾病等,严重危害人体的健康。近年来,随着人们生活水平的提高,糖尿病的发病率也在逐年升高,并且增长速度越来越快,世界卫生组织的统计结果显示,2013年世界糖尿病患者已经达到了3.82亿人,预计2035年这一数字将达到5.92亿人。在我国,糖尿病发病形势也不容乐观,最新统计结果显示,我国患病人数已经达到了约9240万人,成为世界糖尿病第一大国。因此,如何开发出合理有效的糖尿病治疗药物,已经成为全球的研究热点和难点。 2型糖尿病的具体发病机制比较复杂,目前的研究发现,多种因素可以影响胰岛素信号通路中的不同环节,阻碍胰岛素信号的正常转导,造成机体产生胰岛素抵抗,导致胰腺β细胞代偿性的增加胰岛素的表达和分泌,长期以往,胰腺β细胞就会发生坏死,逐渐发展成2型糖尿病;另一方面,胰岛素抵抗导致的血糖升高,机体代谢长期处于失衡状态,也会对胰腺β细胞产生影响,导致其发生凋亡,促进2型糖尿病的发生。 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰岛素激素,其活性形式由30个氨基酸组成。研究发现,GLP-1可以活性形式被肠道直接吸收进入血液,通过血液循环直接作用于胰腺,抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素,刺激胰腺β细胞表达和分泌胰岛素,抑制胰腺β细胞的凋亡,促进胰腺β细胞的分化和再生。GLP-1还可以作用于胃肠道,降低胃肠蠕动速率,减少其对葡萄糖的吸收;作用于神经系统,产生饱腹感;作用于肝脏、肌肉、脂肪等组织和器官,促进糖原的合成,抑制糖异生,加速葡萄糖的利用。因此,GLP-1可以从多个方面发挥作用,降低血糖,并且能够恢复胰腺β细胞功能,从根本上解决糖尿病的发病原因,具有极好的潜在药物开发价值。 本研究利用实验室前期构建的10拷贝串联的口服长效GLP-1编码基因,以酿酒酵母作为宿主细胞,通过整合型表达载体pNK1-PGK将10GLP-1转化入酿酒酵母进行胞内表达,制备包含有10GLP-1的重组酵母,并研究该重组酵母对2型糖尿病的治疗作用。 本研究成功构建了酿酒酵母整合型表达载体pNK1-PGK,并且通过绿色荧光蛋白(GFP)验证其表达功能正常,随后使用该载体将10GLP-1基因转化到酿酒酵母INVSC1中,通过营养缺陷型和Western Blotting成功筛选出了表达10GLP-1的重组酿酒酵母,其生长迅速,表达稳定,表达量达到了1.56mg/g细胞湿重。 通过链脲佐菌素(STZ)和高脂高糖饮食联合诱导的方法构建了2型糖尿病小鼠模型,使用重组酿酒酵母对其进行口服灌胃治疗,发现其具有较好疗效,治疗后血糖水平明显降低。