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马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是马铃薯上重要害虫,也是我国重大检疫对象。阐明马铃薯甲虫调控变态的分子机理有利于新治理措施的开发。本文证实了马铃薯甲虫中RNAi核心基因LdDicer2(LdDcr2)和LdArgonaute2(LdAgo2)的功能。鉴定了马铃薯甲虫中所有的核受体成员。采用RNAi技术干扰LdE75和LdHR3,分析了这些基因干扰后对马铃薯甲虫蜕皮的影响,阐明了这些核受体调控蜕皮的分子机理。获得如下主要结果。1.RNA干扰核心基因的克隆与功能验证为了研究Dicer2和Argonaute2基因在RNAi效率中的作用,克隆了LdDcr2a、LdDcr2b、LdAgo2a和LdAgo2b。其表达量在幼龄明显高于高龄幼虫,当一龄、二龄、三龄和四龄幼虫持续取食6h dsegfp显著提高LdDcr2a、LdDcr2b、LdAgo2a和LdAgo2b的mRNA水平。而当接触时间延长,表达水平逐渐降低。持续取食72 h dsegfp显著抑制一龄、二龄和三龄幼虫体内LdAgo2a和LdAgo2b的表达,显著抑制四龄幼虫中这四个基因的表达。另外,饲喂S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,LdSAHase)基因的dsRNA显著降低四龄幼虫体内靶基因LdSAHase的表达水平,并引起幼虫死亡。三龄幼虫是否取食dsegfp也影响dsLdSAHase的干扰效率。幼虫三龄时若取食dsegfp达12 h,末龄时取食dsLdSAHase后,靶基因沉默效果和死亡率均显著增加。然而幼虫三龄时若取食dsegfp达72h,末龄时取食dsLdSAHase后,LdSAHase的沉默效果和死亡率均显著降低。因此,RNAi核心组件的活力影响RNAi效率。2.核受体家族的克隆及分析基于转录组和基因组数据,鉴定出马铃薯甲虫中核受体成员为21个。根据它们在黑腹果蝇和赤拟谷盗中的同源序列,这些核受体属于七个核受体亚家族。其中NR0亚家族2个,即NROA2(LdKNRL)和NR0A3(LdEagle)。NR1亚家族5个,分别是NR1D3(LdE75)、NR1E1(LdE78)、NR1F4(LdHR3)、NR1H1(LdEcR)和NR1J1(LadHR96)。NR2亚家族成员最多,达到9个。它们分别是NR2A4(LdHNF4)、NR2B4(LdUSP)、NR2D1(LdHR78)、NR2E2(LdTLL)、NR2E3(LdHR51)、NR2E4(LdDSF)、NR2E5(LdHR83)、NR2E6b(LdNameless)和NR2F3(LdSVP)。NR3亚家族成员1个,为NR3B4(LdERR)。NR4亚家族成员1个,为NR4A4(LdHR38)。NR5亚家族成员2个,分别是NR5A3(LdFTZ-F1)和NR5B1(LdHR39)。NR6亚家族成员1个,为NR6A1(LdHR4)。3.核受体E75参与调控化蛹的机理在全变态昆虫的末龄,一个20-羟基蜕皮酮(20E)的高峰和低水平的保幼激素(JH)引起幼虫至蛹的变态发育过程。本章克隆并验证了马铃薯甲虫的两个LdE75 cDNAs(LdE75A和LdE75B)。在幼虫的一到三龄,两个LdE75在龄末都高水平表达。在四龄幼虫期,表达水平在蜕皮40 h和80 h分别形成一个小峰和一个大峰。可见,LdE75A和LdE75B的表达水平与血淋巴中20E滴度同步。体外的中肠孵育实验和体内的生测结果均表明,20E和蜕皮酮类似物氯虫酰肼(Hal)在幼虫末龄上调了LdE75A和LdE75B的表达量。相反,喂食LdSHD的双链RNA(dsRNA)降低20E的水平则下调了LdE75A和LdE75B的表达量。喂食Hal可以回补LdSHD沉默幼虫体内LdE75A和LdE75B的表达量。因此,20E的峰值诱导了LdE75的表达。进一步的实验表明,喂食dsE75-1和dsE75-2两个片段成功敲低了两个LdE75亚型的表达水平,延缓了幼虫的发育。此外,敲低两个LdE75亚型还显著抑制三个蜕皮激素合成基因的转录,降低20E滴度并降低了两个20E响应基因的表达。敲低两个LdE75亚型还诱导了一个JH合成酶基因的表达,提高了JH滴度,增加了一个JH早期响应基因的表达量。因此,LdE75通过影响20E和JH的滴度、参与20E和JH的信号转导而调控幼虫至蛹的变态发育。4.核受体HR3调控化蛹的分子机理克隆了LdHR3。在一、二、三龄幼虫时期,LdHR3每次蜕皮前出现表达高峰。在四龄阶段,LdHR3则在说皮后80 h出现表达高峰。LdHR3的表达高峰与血淋巴中的20E水平基本吻合。体外马铃薯甲虫末龄幼虫的中肠孵育和体内的生测表明,20E和蜕皮酮类似物氯虫酰肼(Hal)增加LdHR3的表达量。喂食dsLdSHD后,在降低了20E水平的同时也降低了LdHR3的表达量,摄食Hal则恢复了LdSHD沉默个体中LdHR3的表达水平。因此,20E高峰直接激活LdHR3的表达。喂食dsHR3-1和dsHR3-2成功敲低了靶标基因LdHR3的表达水平,降低了处理幼虫的化蛹率。敲低LdHR3还上调了三个20E合成基因,增加了20E滴度,激活了二个20E响应基因的表达。然而,沉默LdHR3并不影响JH滴度和JH信号。因此,LdHR3通过影响20E信号转导途径调节马铃薯甲虫的化蛹。