皮下脂肪沉积作为影响猪生长和肉质的主要因素之一,在养猪生产中一直都是被关注的焦点问题。近年来,与猪皮下脂肪沉积相关的基因不断被发现,这为进一步探讨猪皮下脂肪形成的遗传机制奠定了基础,同时也为加快二花脸猪肉品质的改良提供了新的途径。鉴于此,从实验室前期二花脸猪皮下前体脂肪细胞不同分化阶段的全基因转录组分析结果中筛选出长链脂酰辅酶COA合成酶1（ACSL1）和过氧化氢酶（CAT）两个基因作为研究的候选基因。本研究以二花脸猪皮下脂肪组织中的血管基质（stromal vascular,SV）细胞为研究模型,通过干扰基因表达、基因过表达、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测和油红O染色检测SV细胞的分化能力等方法对候选基因进行功能验证和分析。本文的具体过程和结果如下:实验一,ACSL1基因对猪前体脂肪细胞分化的影响。本研究首先对ACSL1基因在猪不同组织和SV细胞分化0、2、4和8 d阶段的基因表达进行检测分析,结果显示在猪皮下脂肪组织中ACSL1基因高表达,并且ACSL1基因的表达水平也会随细胞分化极显著的增加。然后利用siRNA干扰ACSL1基因表达,结果显示ACSL1基因mRNA表达量、蛋白水平、脂肪细胞中甘油三酯合成能力极显著（P<0.01）降低,脂肪分化标记基因PPARγ和C/EBPα无显著变化（P>0.05）,FABP4和APOE基因表达极显著（P<0.01）降低,脂解基因ATGL、HSL基因表达显著升高（P<0.05）;相反,过表达ACSL1基因导致SV细胞ACSL1基因mRNA表达量、蛋白水平和甘油三酯合成能力极显著（P<0.01）升高。早期分化标记基因PPARγ、C/EBPα无显著变化（P>0.05）而脂合基因FABP4和APOE极显著（P<0.01）降低,脂解基因ATGL和HSL也显著降低（P<0.05）。通过生物信息学分析,miR-218-5p靶向ACSL1基因,后续结果也证实miR-218-5p可以显著降低ACSL1基因mRNA和蛋白表达,并且在SV细胞中miR-218-5p可以靶向ACSL1基因显著抑制甘油三酯合成。实验二,siRNA干扰CAT基因表达对猪皮下前体脂肪细胞分化的影响。本研究首先通过qRT-PCR检测CAT基因在二花脸猪皮下前体脂肪细胞分化过程中的表达变化,以及在二花脸猪不同组织的表达谱变化;之后通过siRNA抑制内源CAT基因表达,运用油红O染色检测皮下前体脂肪细胞的分化能力;同时qRT-PCR 检测干扰 CAT基因后PPARγ、C/EBPα、FABP4、APOE、ADIPOQ、PLIN1和HSL等脂肪分化相关基因的表达变化;并进一步检测SOD2、GSS、PRDX3等抗氧化酶相关基因的表达变化。结果显示CAT基因在二花脸猪皮下前体脂肪细胞分化过程中第4天表达量最高,在猪皮下脂肪组织的表达要极显著高于肌内脂肪组织（P<0.01）;降低CAT的表达可显著增加细胞中的H2O2含量,抑制猪皮下前体脂肪细胞的甘油三酯水平（P<0.05）,尽管其对PPARγ、C/EBPα、FABP4和APOE等基因的表达没有显著影响（P>0.05）,但可以显著降低ADIPOQ和PLIN1基因的表达（P<0.05或P<0.01）和升高HSL基因的表达（P<0.05）,而对抗氧化酶相关基因SOD2、GSS和PRDX3的表达则没有显著影响（P>0.05）。综上所述,本研究发现干扰ACSL1基因表达后对猪皮下前体脂肪分化具有抑制作用,表现为降低分化脂合FABP4、APOE基因的表达,同时促进脂解基因ATGL、HSL的表达;过表达ACSL1基因后促进猪皮下脂肪细胞成脂分化,FABP4和APOE基因表达升高,脂解基因ATGL和HSL基因表达降低;最后发现miR-218-5p靶向ACSL1基因,并抑制脂肪细胞分化。此外,本研究还发现在猪皮下前体脂肪细分化中CAT基因可能通过降低细胞中H2O2的水平来实现对脂肪细胞分化的调控,在此过程中主要可能通过调控成脂相关基因PLIN1和ADIPOQ,以及脂解基因HSL的表达水平来最终影响猪皮下前体脂肪细胞的成脂分化。