论文部分内容阅读
目的：利用反向遗传学操作构建登革病毒复制子的反式包装系统；在此基础上,制备登革病毒单轮感染性颗粒,为登革热新型疫苗的研究奠定基础。方法：1.在登革1型病毒广州分离株基因组全长感染性克隆的基础上,利用重叠PCR扩增获得病毒基因组5’端与GFP融合片段,将其插入病毒基因组中以替换病毒的绝大部分结构基因,并获得带有绿色荧光蛋白的病毒复制子DV1-EGFP-RP。同步构建其致死性突变复制子DV1-EGFP△GDD-RP作为对照。通过报告基因和RT-PCR的方法鉴定病毒复制子的复制特性。2.利用重叠PCR扩增获得DV/JEV嵌合型prME片段,将其插入pcDNA3.1质粒构建相应真核表达载体,转染BHK21细胞后,通过RT-PCR和免疫荧光鉴定登革病毒prME的胞内表达特性。利用超速离心对上清中的病毒样颗粒进行纯化,通过电镜和western blot对其进行鉴定。3.为制备获得复制子包装颗粒,首先将病毒复制子RNA电转BHK-21细胞后,再利用脂质体转染方法将辅助包装质粒导入细胞,以使病毒结构和非结构蛋白共表达于宿主细胞中。利用超速离心获得细胞培养上清中的病毒样颗粒,利用RT-PCR、western blot方法对其复制子包装颗粒的生化组分进行鉴定。最后将该病毒样颗粒接种BHK-21细胞,明确其单轮感染性特征。结果：1.获得了高效表达的含绿色荧光蛋白报告基因的登革病毒复制子载体。2.成功构建了登革病毒prME嵌合质粒pcDV/JEV prME,并制备了分泌性病毒样颗粒。3.制备了具有单轮感染性的登革病毒病毒样颗粒。结论：成功建立了基于登革病毒复制子的反式包装系统,制备了具有单轮感染性的病毒样颗粒,为下一步的研究工作打下良好的基础。