原发性肝细胞性肝癌（简称原发性肝癌，HCC）是我国最常见、最具有危害性的恶性肿瘤之一，其发生和发展是一多基因参与和受多因素影响的复杂过程。由蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶精确调控的蛋白质酪氨酸磷酸化水平在此过程中起重要作用。由于很多蛋白质酪氨酸激酶都是由原癌基因编码的，因此一直以来有人推论某些蛋白质酪氨酸磷酸酶可能在体内起抑癌基因的作用，但这个结论直到PTEN/MMACl/TEP1（后简称PTEN）基因发现后才得到证实。作为一个编码蛋白酪氨酸磷酸酶的抑癌基因，PTEN自1997年3月被国际上三个研究小组相继独立地克隆后立即成为细胞信号转导、分子生物学和肿瘤病理学等领域的研究热点，是继p53基因发现之后的又一个“明星分子”。目前的研究认为，PTEN基因的突变与很多恶性肿瘤如神经胶质母细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等的发生密切相关。然而对于在原发性肝癌发生过程中是否有PTEN基因的突变目前报道很少，至于是否有表达水平的改变以及将其转染表达缺失的肝癌细胞后对肝癌细胞生物学行为有无直接影响，目前还未见文献报道。 本研究课题旨在通过应用PCR-SSCP、Northern Blot、Western Blot、免疫组织化学技术以及基因转染等技术，分析原发性肝癌组织和肝癌细胞基因组DNA内是否存在PTEN基因突变，初步探讨PTEN基因突变与原发性肝癌发生的关系，然后从mRNA和蛋白表达水平研究原发性肝癌发生过程中是否有PTEN表达水平的改变，进一步推理PTEN基因在原发性肝癌发生过程中的可能作用；接着采用Northern Blot和Western Blot技术，筛选出一个PTEN表达缺失的肝癌细胞系，直接观察PTEN基因转染该肝癌细胞系后对其细胞生物学行为（增 互98级博士毕业论文 抑癌基因PTEN在人原发性肝细胞性肝癌中的表达、突变及其生物学意义 一文行男殖、软琼脂克隆形成、粘附能力、迁移能力）的影响以及它对p27抑’、MMP上、TIMP－二等表达的影响，从而阐明PTEN基因在原发性肝癌中的作用及其可能分子机制。 采用PCRSSCP检测的结果显示：在60例HCC标本中，发现5类共6个突变位点的存在。其中，出现在外显子内的突变只有一类，即在2例标本的第4外显子中y坝翼下游u吵处检测到C＋T的突变旧903＋T人 该突变导致了PIEN蛋白第84位氨基酸由精氨酸变为赖氨酸。另外四类均位于内含子中，包括在第 4外显子丁瓜翼下游 67 hp处检测到的一个 G＋T点突变柠 25 G—T卜在第 6外显子 3’坝翼下游 58 hp处检测到的一个 T＋A点突变厂］0285 T一N、在第8外显子5’坝翼上游29加处检测到的一个C＋T点突变厂 8833 C—T卜在第8外显子5’池翼上游82加处检测到一个A＋C点突变门 878o A－q。对5株肝癌细胞系基因组DNA检测的结果显示无PTEN基因的突变存在。 采用Northern杂交结果显示：PTEN InRNA在肝癌组织内的表达水平均显著低于对应的癌旁肝组织内表达水平。进一步的分析发现，PTEN 55 kb和 44 kb的转录子表达水平的降低与血清中AFP水平、有无癌栓、有无卫星灶及病理学分级呈负相关中＜0刀5人 而与年龄、血清HBSAg状态、肿瘤大小、组织类型、有无肝硬化、有无包膜无显著相关性：二．4kb 的转录子表达水平降低与血清中HBSAg状态、有无癌栓、有无卫星灶呈负相关中功刀5人 而与病理学分级、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、组织类型、有无肝硬化、有无包膜无显著相关性；但对 1．8 kb转录子的分析结果表明其表达水平的降低只与肝癌的病理学分级呈负相关中＜0刀5人 与其它病理学指标无显著相关性。其中，733％的患者Ph3：N 2．4 kb的tnRNA转录子在癌旁组织内的表达显著高干对应的肝癌组织中叼刀5卜有突变组＊＊＊N InKNInKNA平均表达水平与无突变组P hhN InRNInRNA均无显著性差异中＞0刀5卜然而，在第4外显子内检测到突变的两例HCC标本内，PTEN InRNA 5．5 kb的转录子在癌组织内的表达水平显著高于癌旁组织。 PTEN蛋白在肝癌组织中的阳性表达与患者年龄年龄、血清HBSAg状态、肿瘤大小、组织类型、有无肝硬化、有无包膜等无相关性，但与病理学分级、有无癌栓和有无突变呈负相关中功刀5人 采用基因转染技术将PTEN基因转染肝癌细胞株Hub7发现：PTEN基因转染使p7抑‘表达水平显著升高中功刀5人阻滞讪卜7细胞周期进展，抑制HU卜7 298级傅士毕业论文 抑癌基因pcI7N在人原发性肝细胞性肝癌中的表达、突变及其生物学意义 中文打罗细胞生长增殖和克隆形成能力；而且PIEN显著降低Hub7表达M：Nl，上的水平，而升高TIMP－2的表达，从而抑制Hub7的浸润迁移能力。另外，PTEN还可选择性抑制Hub7细胞与特异性粘附底物的粘附作用。 本研究结果表明