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脊髓损伤是一种常见的创伤类型,具有较高的致死、致残率。由于脊髓原发性损伤后导致的继发性神经元损伤机制极为复杂,临床上使用的药物很难同时作用于多种损伤机制,而且过度一味地遏制某些继发性损伤机制而忽略其对机体有利的一面,反而会带来副作用,所以目前临床上治疗急性脊髓损伤仍缺乏确实有效且相对安全的药物。我们试图寻找一个新的治疗靶点,作用于这个新靶点能激活机体内在的自我调控机制,使各种应激反应存在于一定的程度和范围之内,并且作用于该靶点可以同时干预多种继发性神经元损伤机制,避免以往治疗的片面性。Nrf2-ARE通路是细胞内在的一种调节机制,研究表明,该通路激活后,会同时发挥多重的保护作用,它们恰恰涵盖了脊髓损伤后多种重要的继发性损伤的防御机制,包括抗氧化应激、调节炎症损伤、拮抗细胞凋亡、缓解钙离子超载等。已有研究表明,Nrf2-ARE通路的激活与小鼠脊髓损伤具有相关性。因此,我们设想,以Nrf2-ARE通路作为治疗脊髓损伤的新靶点可能会起到较好的神经功能保护作用。本研究从正向及反向两个方面调控Nrf2-ARE通路,利用钳夹法制作小鼠脊髓损伤模型,观察Nrf2-ARE通路在脊髓损伤后的神经功能保护作用,并深入研究其作用机制。第一部分绪论本节旨在对Nrf2-ARE通路在炎症反应中的保护作用、脊髓损伤模型的制备及评价、脊髓损伤后脊髓炎症反应的研究现状及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在中枢神经系统中的作用等方面进行综述。第二部分正向调控Nrf2-ARE通路对小鼠脊髓损伤后的治疗作用及其抗炎机制研究脊髓损伤后继发性神经元损伤的机制非常复杂,而炎症反应在其中发挥着重要的作用。在急性脊髓损伤后早期适度的控制炎症反应有利于减轻神经元的损伤,利于神经功能的恢复。莱菔硫烷(SFN)是Nrf2-ARE通路的激动剂,它是从十字花科蔬菜中提取的植物化学活性物质,它激活Nrf2-ARE通路后可以诱导Ⅱ相酶的表达从而发挥抗氧化应激及抗炎作用。因此,我们设想,在脊髓损伤早期利用莱菔硫烷正向激活Nrf2-ARE通路,应该可以减轻炎症反应,起到保护神经功能的治疗作用。本研究选择Nrf2(+/+)ICR小鼠和Nrf2(-/-)ICR小鼠为实验动物,采用具有恒定夹闭力的动脉瘤夹钳夹暴露好的小鼠脊髓制作急性脊髓损伤模型,治疗组小鼠在脊髓损伤后1h腹腔注射莱菔硫烷,安慰剂组腹腔注射等量的玉米油。从小鼠脊髓损伤后当天开始直至伤后7天,采用BMS(Basso Mouse Scale)法对各实验组小鼠后肢运动功能进行评分；伤后48h行受损脊髓病理切片组织学损伤程度评分,神经元Fluoro Jade C (FJC)免疫荧光染色进行变性或坏死神经元计数,干湿比法测定脊髓水肿程度；伤后12或24h用EMSA法检测炎症信号通路上游调控因子NF-κ B及核转录因子Nrf2的活性,RT-PCR法检测受损脊髓内MMP-9、水通道蛋白-4(AQP4)、炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)及抗氧化/解毒酶(NQ01.GST-α1)mRNA表达水平,ELISA法测定炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)蛋白含量,Western blot法检测MMP-9.AQP4蛋白含量,明胶酶活性测定法检测MMP-9酶活性的变化,比色法测定NQ01.GST-α1酶活性变化；最后进行组间比较。研究发现,Nrf2(+/+)ICR小鼠脊髓损伤后早期即出现后肢运动功能障碍,腹腔注射SFN可以在早期改善其后肢运动功能,并可减轻脊髓组织学损伤、减轻脊髓水肿,减少神经元的变性坏死。进一步研究发现,这种保护作用伴随着伤后早期治疗组Nrf2(+/+)ICR小鼠NF-κ B活性的下降及Nrf2活性的升高,伴随着治疗组MMP-9及炎症介质(TNF-α、IL-6、IL-1β)mRNA及蛋白表达的下降,伴随着治疗组脊髓内AQP4mRNA及蛋白表达的增加,以及抗氧化/解毒酶(NQ01.GST-α1)mRNA表达及酶活性的增加。而Nrf2(-/-)ICR小鼠在脊髓损伤后6h BMS评分明显下降直至伤后4天,此后BMS评分好转亦不明显,较Nrf2(+/+)ICR小鼠明显下降,使用SFN后BMS评分没有改善；Nrf2(-/-)ICR小鼠在脊髓损伤后48h脊髓水肿较Nrf2(+/+)ICR小鼠明显加重,使用SFN后脊髓水肿也未见好转。这一部分结果说明在小鼠急性脊髓损伤后正向调控Nrf2-ARE通路可诱导Ⅱ相酶表达的增加,并通过抑制NF-κB炎症信号通路的活化发挥其抗炎作用,从而改善小鼠脊髓损伤后神经功能的缺失,起到治疗的效果。第三部分反向调控Nrf2-ARE通路对小鼠脊髓损伤后神经功能障碍的影响及其机制研究在许多炎症相关性疾病,例如自身免疫性疾病、哮喘、肺气肿、大肠炎、动脉粥样硬化、创伤性脑损伤等疾病中,Nrf2-ARE通路发挥着减轻炎症反应的作用。反向调控Nrf2-ARE通路,利用Nrf2基因敲除小鼠,它表现出对炎症反应的易感性,导致机体损伤加重。Nrf2-ARE通路在小鼠脊髓损伤中的保护作用尚缺乏研究。本研究选择Nrf2(+/+)ICR小鼠和Nrf2(-/-)ICR小鼠为实验动物,采用具有恒定夹闭力的动脉瘤夹钳夹暴露好的小鼠脊髓制作急性脊髓损伤模型。从小鼠脊髓损伤后当天开始直至伤后4周,采用BMS(Basso Mouse Scale)法对各实验组小鼠后肢运动功能进行评分：伤后4周用脊髓运动诱发电位(spinal motor-evoked potentials,MEPs).足印迹法评定小鼠后肢运动功能;伤后48h行受损脊髓病理切片组织学损伤程度评分,神经元Fluoro Jade C(FJC)免疫荧光染色进行变性或坏死神经元计数,干湿比法测定脊髓水肿程度；伤后24h用EMSA法检测炎症信号通路上游调控因子NF-κ B及核转录因子Nrf2的活性,RT-PCR法检测受损脊髓内MMP-9.炎症细胞因子(TNF-α、IL-6.IL-1β)及抗氧化/解毒酶(NQ01. GST-α1)mRNA表达水平,ELISA法测定炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)蛋白含量,Western-blot法检测MMP-9蛋白含量,明胶酶活性测定法检测MMP-9酶活性的变化,比色法测定NQ01、GST-α1酶活性变化；最后进行组间比较。研究发现,在脊髓损伤后Nrf2(-/-)ICR小鼠较Nrf2(+/+)ICR小鼠相比,后肢运动障碍更为严重,恢复缓慢；与之相伴随的是更为严重的脊髓水肿及组织学损伤,更多神经元的变性坏死。深入研究其机制,Nrf2(-/-)ICR小鼠在脊髓损伤后NF-κ B活性较Nrf2(+/+)ICR小鼠相比更为增强,表现为更为剧烈的炎症反应,MMP-9.炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达更为增多,MMP-9的酶活性更为增强。相反,Nrf2(-/-)ICR小鼠在脊髓损伤后Nrf2活性没有升高,其下游的抗氧化／解毒酶(NQ01.GST-α1)表达及活性很低,失去了抗氧化应激损伤的能力。这一部分结果说明,反向调控Nrf2-ARE通路,将Nrf2敲除后,小鼠失去了自身抗氧化损伤的能力,导致脊髓损伤后脊髓内的炎症反应更为剧烈,加重了神经功能的障碍。这一点恰恰从反面证实了Nrf2-ARE通路在小鼠体内发挥着重要的抗炎保护作用。小结脊髓损伤是较常见的外伤类型,严重影响患者的生存质量,其治疗的重点和难点是如何减轻并改善脊髓损伤后的神经功能障碍。但目前临床上治疗急性脊髓损伤仍缺乏确实有效且相对安全的药物。Nrf2-ARE通路是细胞内在的一种保护调节机制,其下游分子涉及多种细胞保护作用,但该通路在脊髓损伤中对神经功能的保护作用及其机理不十分明确。本研究一方面利用Nrf2-ARE通路的激动剂作为对该通路的正向调控,另一方面利用Nrf2基因敲除小鼠作为反向调控,采用具有恒定夹闭力的动脉瘤夹钳夹暴露好的小鼠脊髓制作急性脊髓损伤模型,观察脊髓神经元坏死、脊髓组织学损伤、脊髓水肿及小鼠后肢运动功能受损的程度,并从调控炎症反应方面阐明其作用机制,通过对照分析,我们得出结论：激活Nrf2-ARE通路可以通过内在性的抑制NF-κB炎症信号通路起到调节炎症反应的作用,从而改善小鼠脊髓损伤后的早期神经功能障碍,为找寻脊髓损伤治疗的新靶点及新药物提供了理论依据和实验基础,为脊髓损伤的治疗策略提供一个新的思路和方向。