目的:血管性痴呆(vascular dementia, VD)是由各种脑血管疾病引起的获得性、持续性认知功能障碍综合征,以学习和记忆功能障碍、执行能力下降为主要临床表现。近年来,VD的发病率逐年提高,严重地威胁着老年人的身心健康,也给社会和家庭带来了沉重的负担。目前,VD的发病机制还不十分清楚,因此,深入研究VD的发病机制仍是当前医学界的热点课题。深入研究VD的发病机制就需要建立理想的VD动物模型。目前已有多种VD动物模型,但尚无一种公认的标准模型,因此制备最接近人类VD特征的、可靠的动物模型就成为医学界十分关注的课题。本研究采用小鼠做为观察对象,采用双侧颈总动脉结扎反复脑缺血-再灌注合并尾端放血的方法制备VD小鼠模型,通过跳台和水迷宫试验对其进行行为学测试。海马组织与学习和记忆功能关系密切,其中神经元和突触的数量和形态正常与否对学习和记忆的产生和维持具有重要作用。资料表明,学习和记忆功能与海马神经元突触可塑性密切相关,突触丢失和结构改变与认知功能下降有直接关系。本课题组已观察到VD时海马神经元细胞核肿胀,细胞器减少;轴突中神经微管结构模糊,树突和轴突均有不同程度水肿,突触的数量减少;突触小泡破裂等。证明海马神经元的超微结构变化导致了神经元功能异常、突触可塑性降低,在VD发病机制中起重要作用。在此基础上本研究应用透射电镜进一步观察VD时海马CA1区神经元突触的变化特征,为探讨其发病机制提供更多形态学依据。第四脑室外侧隐窝位于第四脑室与蛛网膜下腔之间,是脑脊液循环的必经之路,也是脑内物质交换和信息传递的重要位点,对脑脊液内免疫信息分子具有重要的监控作用,并且还可调节多种神经内分泌功能和神经免疫功能。室管膜位于血液-脑脊液-神经组织三种不同信息交汇处,其位置的特殊性决定了它在大脑功能中起着重要的作用。有学者报道,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)时,在脑室的室管膜细胞内也有神经原纤维缠结和淀粉样沉积。本课题组已观察到VD时第四脑室外侧隐窝的室管膜上纤毛减少、排列紊乱,分泌颗粒增多,室管膜上细胞数目减少,胞体变小而突起减少。推测这些改变在VD的发病机制中有重要作用。在以上研究的基础上,本研究进一步观察VD时室管膜细胞及室管膜细胞上结构的变化特征,以探讨其可能的发病机制。方法:本研究分为三部分第一部分以小鼠为研究对象,采用双侧颈总动脉结扎的方法,经过三次反复脑缺血(ischemia, I) -再灌注(reperfusion, R),建立VD小鼠模型,并设立假手术组,在模型制备后的第29、30天,利用跳台和水迷宫试验对两组小鼠进行学习和记忆成绩测试。第二部分采用3%多聚甲醛和1%戊二醛固定液灌流固定后取海马CA 1区组织进行透射电镜观察。第三部分采用3%多聚甲醛和1%戊二醛固定液灌流固定后取第四脑室外侧隐窝进行扫描电镜观察。结果:1两组小鼠的行为学评价术后第29天,测试跳台试验的反应时间(sec)和错误次数(number/5 min)作为学习成绩;水迷宫试验游完全程的时间(sec)和错误次数(number/3 min)作为学习成绩。术后第30天测得成绩为记忆成绩。1.1学习成绩(1)跳台试验结果示:①VD模型组小鼠的反应时间与假手术组相比明显延长(P<0.01);②VD模型组小鼠的错误次数与假手术组相比明显增多(P<0.05)。(2)水迷宫试验结果示:①VD模型组小鼠游完全程的时间与假手术组相比明显延长(P<0.01);②VD模型组小鼠的错误次数与假手术组相比明显增多(P<0.01)。1.2记忆成绩(1)跳台试验结果示:①VD模型组小鼠的潜伏时间与假手术组相比明显缩短(P<0.01);②VD模型组小鼠的错误次数与假手术组相比明显增多(P<0.01)。(2)水迷宫试验结果示:①VD模型组小鼠游完全程的时间与假手术组相比明显延长(P<0.01);②VD模型组小鼠的错误次数与假手术组相比明显增多(P<0.01)。2应用透射电镜观察海马组织CA1区的超微结构变化2.1假手术组:突触丰富,典型者为突触前膜中可见线粒体、突触小泡聚集,靠近突触间隙一侧,突触间隙清晰可见,突触后膜较厚,为均匀的致密物质。2.2 VD模型组:小鼠海马CA1区突触数量减少,部分突触形态异常,突触前成分内线粒体数量减少、结构改变,突触小泡数量减少,突触间隙大部分融合,模糊不清,突触后致密物质减少。3应用扫描电镜观察第四脑室外侧隐窝室管膜超微结构变化3.1假手术组:①室管膜细胞排列规律,其表面可见大量纤毛和微绒毛。纤毛粗长,排列丛密;纤毛之间可见密集的、细而短的微绒毛。②室管膜细胞上可见圆球形的、表面光滑的分泌颗粒。3.2 VD模型组:①室管膜细胞表面的纤毛和微绒毛的数量明显减少;暴露的室管膜细胞之间出现沟隙,细胞表面凹凸不平,甚至出现裂口;在室管膜细胞表面可见淤泥样分泌物,部分纤毛倒伏在淤泥里,其上可见纤毛压迹;②室管膜细胞上的分泌颗粒明显增多,其表面变的凹凸不平,有的分泌颗粒的膜表面向内塌陷,呈杯口状;有的分泌颗粒形状不规则。结论:1本实验成功的建立了VD小鼠模型,经跳台和水迷宫试验证实了VD小鼠存在学习和记忆功能障碍,能够基本模拟临床上VD患者的智能障碍,是比较理想的VD动物模型。2 VD模型组海马CA1区突触数目减少,部分突触形态异常,突触前成分内线粒体数量减少、结构改变,突触小泡数量减少,突触间隙部分融合,突触后致密物质变薄。以上结果提示神经元冲动传递能力下降,这些异常改变可能参与了VD的发病。3 VD模型组第四脑室外侧隐窝室管膜上纤毛和微绒毛数量减少,出现淤泥样分泌物,室管膜细胞皱缩,细胞间出现裂隙,纤毛根部出现许多小裂口。以上结果提示室管膜细胞功能减退,细胞代谢和信息物质的传递能力下降,这些异常改变可能参与了VD的发病。