研究背景蛋白磷酸化水平由蛋白激酶和蛋白磷酸酶进行精细的协同调节,影响细胞很多方面的生理功能。蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatases, PTP)家族是细胞信号转导的重要调节因子。研究显示,所有的经典的PTP的催化机制基本相同,并已经得到比较清晰的阐述。之前的研究主要集中在活性中心的第一层氨基酸,即直接参与底物结合或催化的氨基酸。而对于第二层氨基酸的关注则相对较少。然而,第二层氨基酸对PTP的催化活力与底物识别特异性同样具有潜在的重要性,值得我们深入研究。研究目的研究活性中心第二层氨基酸残基T263对PTP1B(Protein tyrosine phosphatases 1B, PTP1B)磷酸酶活力和功能的调节材料与方法本文以pT7-7-PTP1B, cDNA4-PTP1B质粒为模板,构建Thr263的突变体。首先将cDNA4-PTP1B野生型及Thr263突变型质粒转染入HepG2细胞中,通过检测PTP1B负调控胰岛素信号通路的能力来确定PTP IB野生型及Thr263突变蛋白活性的差异。然后将pT7-7-PTP1B野生型及Thr263突变型质粒转化入E.coliBL21中进行表达,并使用CM弱阳离子交换柱以及分子筛纯化表达的蛋白。将纯化的蛋白进行蛋白结晶,研究Thr263对蛋白结构的影响。选择pNPP、磷酸化短肽作为底物来观察Thr263突变对PTP1B基本酶活的影响。通过检测Thr263突变体的kcat、Km、Kcat/Km,阐明Thr263突变如何改变PTP1B去磷酸化的过程。通过测定其对pH依赖性和解离基团pKa的依赖性,来阐明Thr263在PTP1B催化中的作用。最后通过对PTP1B及Thr263突变蛋白结构的解析,直观阐明Thr263在PTP1B蛋白空间结构中的作用。结果细胞实验显示,Thr263突变使PTP1B活性降低,其负调控胰岛素信号通路的能力减弱。蛋白基本活力的测定结果显示Thr263突变蛋白的磷酸酶活性减弱,Thr263突变同时影响酶的keat和Km。从晶体结构上看,Thr263与胰岛素受体(Insulin receptor, IR)的1164位R相互之间有疏水作用,而与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)没有此作用,进一步显示Thr263能影响PTP1B的底物特异性。PTP1B及其突变体的pH和底物解离基团的依赖性研究,证实Thr263突变影响了PTP1B的酸碱催化机制中通用酸的功能,同时影响蛋白的催化反应和底物结合两个方面。PTP1B及Thr263突变蛋白的晶体结构分析,显示T263与F182的疏水作用对稳定WPD loop有重要作用,而突变破坏了这种作用,进而影响PTP1B的酶活和底物选择性。结论1.第二层氨基酸Thr263在PTP1B调控胰岛素信号通路中起重要的作用。Thr263突变使PTP1B对胰岛素信号通路的负调控作用降低甚至消失。2. PTP1B Thr263突变使PTPIB的体外催化活性明显降低.3.Thr263突变能够影响PTP1B催化的化学反应过程和底物结合过程。4.Thr突变蛋白扰乱通用酸Asp181的功能,使蛋白活性降低。5. PTP1B T263通过与F182的疏水作用来稳定通用酸Asp181,调控WPD loop移动,进而稳定底物解离。6.T263：F182之间的疏水作用是磷酸酶活性和底物特异性识别的决定性因素。