【摘 要】
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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)药用草本植物,其主要活性成分人参皂苷一直是人们关注的热点。灵芝(Ganoderma lucidum)是一种古老是药用食用菌,灵芝酸作
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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科(Araliaceae)药用草本植物,其主要活性成分人参皂苷一直是人们关注的热点。灵芝(Ganoderma lucidum)是一种古老是药用食用菌,灵芝酸作为其主要活性成分,具有多种药理活性作用。人参皂苷与灵芝酸同为萜类化合物,在合成代谢中包含了部分相同的代谢途径——甲羟戊酸途径(MVA)。本文旨在探索吉林人参脱羧酶基因(Decarboxylase,DC)起源与进化、结构与功能、及其表达活动,分析其在人参皂苷合成及生长发育等方面的作用,为今后人参脱羧酶系统的研究提供资源和依据;大片段DNA遗传转化手段作为多基因转化的主要方式,更适应于多基因调控机体性状和功能的研究。开展携带有与萜类骨架合成相关的人参脱羧酶基因的人参大片段转化灵芝的研究,将丰富灵芝的种质资源,为实现灵芝作为生物反应器生产人参皂苷奠定基础。主要研究结果如下:1.本研究从吉林人参248,993 Unigenes数据库中筛选分离得到166个吉林人参DC基因。2.Pathway定位结果表明,吉林人参DC基因定位到33个代谢途径,有4个Unigenes定位到了萜类化合物骨架的合成,这4个Unigenes均为Pg MVD(Diphosphomevalonate Decarboxylase)基因。3.吉林人参DC系统进化分析显示,每类脱羧酶在进化过程中均具有较高的保守性;吉林人参Pg MVD基因的进化与三七(Panax notoginseng)Pn MVD的亲缘关系最为接近。4.吉林人参DC在14组织器官、4个不同年生根及42个农家品种中该基因表达量热图分析表明,某一类吉林人参DC在不同组织部位、不同发育时期以及不同的生长环境下表达量均不同;从吉林人参脱羧酶基因的互作网络分析,大部分脱羧酶基因的表达活动都是协同互作来完成生命活动。5.吉林人参PgMVD4蛋白质分子质量为46,618.4Da,是亲水性蛋白,蛋白二级结构包括α螺旋(Alpha helix)、β转角(Beta turn)、延伸链(Extended strand)和无规卷曲(Random coil)。在生物学过程、分子功能及细胞组分三方面共注释到6个GO-Terms,分别为类异戊二烯生物合成的过程(GO:0008299)、异戊烯基焦磷酸生物合成过程(GO:0019287)焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性(GO:0004163)、结合ATP活性(GO:0005524)及羧酶活性(GO:0016831)及细胞质(GO:0005829)。6.携带有与萜类骨架合成相关的人参脱羧酶基因的人参大片段DNA电击穿孔法转化灵芝原生质体。转化条件为制备原生质体菌龄为6d,卡那霉素筛选压为12mg/ml,电压为700v,DNA与原生质体比例为1:4,共获得抗性转化子2个。
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