外胚间充质是脊椎动物一个独特的结构，它包含了迁移来的颅神经嵴细胞及其衍生物。颅神经嵴细胞被认为具有最高的分化潜能，它可以分化成为神经和间充质两个胚层的组织，是一种具有多向分化潜能的干细胞。多年来通过对鸟类和哺乳动物体内、体外以及细胞水平的研究，对颅颌面部的发育和形成的神经嵴-外胚间充质的模式已经有了深入的了解。 在发育过程中，颅神经嵴细胞经历了三个主要步骤：从神经外胚层迁移至咽弓；在外胚间充质中增殖；最后分化成为颅颌面部的大部分组织。迁移的神经嵴细胞与周围组织的细胞相互作用，经历了一个从上皮到间充质表型的转化过程。以前研究认为神经嵴细胞的分化逐渐受到限制。然而1990年Baroffio等发现大约有2.6％的迁移的颅神经嵴细胞可以分化成神经和间充质两个胚层的许多衍生组织，提示迁移的细胞中包含具有多分化潜能性的颅神经嵴干细胞。目前还不清楚未分化的神经嵴干细胞迁移至外胚间充质后是否还存在，但是神经嵴是一个暂时性结构，而颅颌面部的大部分组织结构都由外胚间充质发育而来，提示外胚间充质也类似神经嵴是一个具有多分化潜能性的结构。因此，我们认为外胚间充质中包含迁移的神经嵴干细胞或其转化的干细胞-外胚间充质干细胞(Ecto-mesenchymal stem cell EMSC)。 第四军医大学博士学位论文 最近一些研究支持了这一观点，例如牙髓干细胞的发现，它存在于牙髓组织中，被认为来源于外胚间充质。另外一些研究显示神经峭干细胞迁移后仍然存在于它所迁移的组织中，一些时候它们的表型可以发生迅速改变。在周围神经系统中也存在神经峭干细胞，并且在体内可以自我更新。Labat等从长期培养的外周血单核细胞发现了一种神经晴来源的间充质干细胞，这种细胞同时表达神经外胚层和中胚层的标志，说明外胚间充质干细胞可能在体内长期存在。尽管许多证据显示EMSC的存在，但是目前对它的研究较少，还没有进行系统的鉴定和分离。 本研究旨在分离外胚间充质干细胞，并研究其可塑性。主要研究的内容和结果如下:1领突外胚间充质细胞的形态及表型鉴定1.1领突外胚间充质细胞的形态学研究 分离胚胎为E12.5 SD大鼠胚胎领突组织，制备电镜标本，观察外胚间充质细胞的超微结构。结果显示外胚间充质细胞主要为间充质样细胞，形状不规则，呈多突起的星形或梭形，突起不规则;核、浆比例大;核仁明显，大、靠边;常染色质多，异染色质少;高倍电镜显示细胞内部有大量的线粒体、少量粗面内质网和核糖体:未发现其它成熟己分化细胞，例如:脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞以及神经肌肉组织细胞及其超微结构特征，因此结果表明外胚间充质细胞代谢旺盛，增殖活性高，处于未分化状态。1.2领突外胚间充质细胞的表型鉴定 分离胚胎为E12.5 SD大鼠胚胎领突组织，制备石蜡标本，免疫组化鉴定外胚间充质细胞的分子表达。组织化学染色显示大部分领突间充质细胞表达神经峭干细胞的标志低亲和力神经生长因子受体LNGFR，Nestin，和人自然杀伤标志HNK一1，提示外胚间充质中存在表达神经峭干细胞标志的细胞。同时，外第四军医大学博士学位论文胚间充质细胞表达S一100，波形丝蛋白Vimtine，但不表达成熟细胞的标志。S一100是神经胶质前体细胞和神经峭来源的间充质前体细胞的标志，但是在中胚层来源的间充质细胞中不表达，说明外胚间充质细胞是一种幼稚的未分化细胞，并且来源于神经峭。结果说明外胚间充质中存在着迁移的神经峭干细胞或其转化的干细胞，我们称之为外胚间充质干细胞。2领突外胚间充质干细胞的分化研究2.1磁珠分离领突外胚间充质干细胞 采用差异消化贴壁法分离和纯化培养SD大鼠领突外胚间充质细胞;利用磁珠技术分离具有神经靖干细胞标志一LNFGR的外胚间充质干细胞，倒置显微镜观察细胞生长特性;利用免疫荧光双标技术鉴定分离的细胞。结果显示磁珠分离的外胚间充质细胞呈成纤维细胞样细胞生长，状态稳定;免疫荧光结果显示磁珠分离的LNGFR十的细胞共表达神经峭干细胞的其它标志Nestin和HNK一1，结果说明成功分离了LNGFR+的外胚间充质干细胞，为下一步研究打下了良好的基础。2.2诱导领突外胚间充质干细胞向骨骼肌细胞分化 利用DMSO诱导外胚间充质干细胞分化，通过免疫组化和RT一尸CR鉴定，以大鼠成纤维细胞作为对照。结果显示外胚间充质干细胞经DMSO诱导后，细胞形态发生变化，细胞明显变大、变扁平，开始有管状排列现象，细胞与细胞之间互相融合，即成为肌管细胞，此时细胞内有数个细胞核象串珠样排列在细胞中央;免疫组化结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达骨骼肌细胞的标志Desmin;RT一PCR鉴定结果显示诱导的外胚间充质干细胞表达成肌细胞特异标志一Myod mRNA。而对照组细胞形态未出现变化，也无骨骼肌细胞标志表达。以上说明外胚间充质干细胞被DMSO诱导成为骨骼肌细胞。2.3诱导领突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化 第四军医大学博士学位论文 利用矿化液诱导外胚间充质干细胞分