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登革病毒(dengue virus，DENV)是黄病毒属、有包膜的的单股正链RNA病毒，由于包膜蛋白的抗原性不同，它分为四种血清型，即DENV1～4。DENV以蚊虫为媒介广泛流行于热带和亚热带地区。每年，登革病毒会导致数百万人感染，引起登革热(denque classical fever，DF)和登革出血热/休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengueshock svndrome，DHF/DSS)。DF是自限性发热性疾病；而DHF/DSS则是威胁患者生命的重症，其主要特征是血管通透性显著增加，导致血浆渗漏。每年有大约50万DHF/DSS患者需要及时入院治疗，否则病死率高达50％。然而，DHF/DSS的发病机制，以及DENV与宿主细胞之间相互作用的机制尚不清楚。
微丝又称肌动蛋白纤维(fibrous-actin，F-actin)，由球形肌动蛋白(global-actin，G-actin)首尾相连而成。作为细胞骨架的重要组成之一，微丝系统是有极性的动态结构。它们一般以成束或成网的形式存在于细胞质膜内，构成所谓的细胞皮质区，调控细胞的形状、表面突起和运动等。当受到某些细菌或病毒的感染时，微丝能解聚并形成新的结构，参与病原体进入、胞内运输及释放等过程。既往研究表明，病毒通常采取两种策略完成其胞内运输：利用膜泡运输或/和参与调控细胞骨架的信号通路，例如smallGTPase家族。但它们是否参与DENV感染尚未见文献报道。
微丝研究中最常用的药物有2类：一类与微丝的正端结合，起抑制G-actin聚合的作用，如细胞松弛素D(cytochalasin D，cyt D)；另一类与微丝的侧基结合，贯穿微丝的生长，起稳定F-actin和对抑制解聚的作用，如jasplakinolide(jas)。
本研究主要以来自胎儿脐静脉的上皮样细胞株ECV304细胞为对象，以登革病毒2型(DENV2)为感染材料，探讨DENV2是否与细胞微丝骨架相互作用，及其中可能的分子机制。首先，应用两种干扰微丝骨架功能的药物(jas和cyt D)，分析了微丝骨架在整个DENV2感染过程中的作用；随即应用瞬时转染实验和免疫共沉淀实验，研究了DENV2 E蛋白与微丝的相互作用；最后，通过观察Rac的分布与活性变化，探讨了在DENV2感染中该调控通路与微丝重排的关系。期望能从不同的角度分析细胞微丝骨架在DENV2感染宿主细胞过程中的作用，为深入理解DHF/DSS的发病机制提供理论依据。本研究主要结果与结论如下：
DENV2感染引起ECV304和HUVEC细胞微丝骨架的解离聚合：
首先，我们观察了DENV2感染之后，细胞微丝骨架的排布变化。在模拟(mock)感染的ECV304细胞中，F-actin主要以应力纤维(stress fiber)的形式存在，广泛分布于细胞内，包括细胞边缘部分。以MOI=10对细胞进行感染，感染10分钟内，细胞微丝出现了解聚，较多的短F-actin积聚形成团块；感染后30分钟，应力纤维几乎完全解聚，F-actin呈大小不一、数量不等的散点状；感染1小时后，部分应力纤维束开始恢复，主要分布在细胞膜下的皮质区。这提示DENV2的感染进入可能引起了微丝骨架的改变。
感染24小时后，由于病毒大量复制、病毒蛋白堆积，能够再次引起F-actin的解聚，尤其是核周区域。其中有些细胞内形成了特殊的短F-actin结构，与病毒蛋白的分布紧密相伴，形态类似文献所报告的肌动蛋白尾(actin tail)。实验结果提示，除了进入之外，微丝骨架可能参与了DENV2感染过程中的其它环节。jas和cyt D在DENV2感染过程中的作用根据形态学的结果，我们研究了微丝在DENV2进入中的作用。首先，用不同剂量的干扰药物预先处理Vero细胞5、3、或1小时，然后实施感染实验并计数噬斑形成数。结果发现，与模拟处理组相比较，jas和cyt D高浓度药物组(预处理5小时)的噬斑数明显减少，两组分别降低至对照水平的50％或75％。并且，药物的这一抑制作用在一定范围内，随着药物的用量增加和预处理时间的延长而增强，具有明显的剂量和时间依赖性。这提示，当微丝聚合和解离的平衡被破坏时，DENV2感染效率能够受到抑制。
为确定DENV2复制周期哪一个环节与微丝骨架的关系更为密切，我们在感染后不同时相点(0小时、3小时或6小时)向培养上清中添加了jas或cyt D，然后在感染后9小时收集上清和细胞样本，进行病毒滴度检测。结果显示，两种药物均使得细胞内病毒滴度出现明显下降，并且下降幅度与处理时间相关。但是，两种药物对上清病毒滴度的影响趋势却有所不同。随着处理时间的缩短，jas组中的上清病毒滴度逐渐增加(3～9小时组)，并接近对照水平(6～9小时组)。然而，cyt D组对上清病毒滴度的抑制更为显著，上清中的病毒滴度始终维持在对照水平的40～50％左右。这提示微丝解离与聚合的动态平衡破坏对整个感染过程有抑制作用，而病毒的释放可能与微丝的重新聚合更为密切。在计算药物处理后细胞内外病毒滴度的比值(ratios)的变化时，我们发现两种药物处理后该比值均出现明显下降，也即细胞外病毒滴度的降低较细胞内更为明显，据此推测病毒的释放可能部分被阻断。进一步分析发现，jas处理引起的比值下降具有时间依赖性，而cyt D则不同。当cyt D在感染后即刻(0小时)添加，维持至9小时，其比值为81.0％．然而在感染后3小时和6小时添加，其比值分别为49.5％和50％，这表明微丝解离与聚合的平衡对于DENV2的释放可能比处于稳定状态的微丝更为重要。
为进一步阐明微丝在病毒释放过程中的作用，我们利用免疫荧光染色技术，观察了药物处理72小时病毒抗原在细胞内的分布，在模拟处理组，病毒抗原主要分布在核周或核周一侧。但在cyt D或jas处理的ECV304细胞，大量的病毒抗原呈团块状弥散分布在胞浆内，进一步证明微丝解离和聚合的失衡对DENV2的释放有显著的抑制作用。
DENV2 E蛋白与微丝骨架的相互作用有文献报道某些病原体外膜蛋白与微丝骨架相互作用可以诱导微丝的重排，为此，我们研究了DENV2 E蛋白与微丝骨架的联系。首先，用表达E蛋白的质粒瞬时转染ECV304．细胞，并在转染后48小时观察微丝骨架的排布。结果可见，随着E蛋白在核周的大量表达堆积，微丝骨架解聚、弥散于胞浆。微丝的这一变化与DENV2感染HUVEC所见相似，提示E蛋白可能是触发微丝重排信号通路的重要的病毒蛋白。其它病毒蛋白与DENV感染后微丝骨架重排的关系，正在研究之中。
除Rac分布方式外，Rac在DENV2感染过程中活性的变化更值得关注。Rac是Small G protein家族的成员，在激酶的作用下，没有活性的GDP-Rac可以被磷酸化为具有活性的GTP-Rac，并与PAK1相结合。因此我们自行制备的可溶性PAK1活性片断CRIB，并用免疫组化方法检测了DENV2感染后Rac活性的变化。结果显示，在模拟细胞中，没有观察到GTP-Rac堆积，整体背景呈现弥散性的浅棕色。然而在DENV2感染的细胞中，部分细胞核周区域出现深棕色的强阳性反应，提示Rac的活性在感染后可能有明显提高。
综上所述，微丝骨架在DENV2的整个感染过程中起重要作用，特别是病毒的释放。DENV2 E蛋白能够引起微丝骨架重排，并与微丝共存，提示E蛋白可能是参与病毒与微丝相互作用的重要组分。Rac可能参与了DENV2感染后微丝骨架的激活。这一实验结果为深入理解DENV与宿主细胞的相互作用、深入阐明DHF/DSS的发病机制提供了重要的实验依据．当然，DENV蛋白与微丝相互作用的机制以及其中所涉及的信号调控通路还有待于深入研究。