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青霉素酰化酶具有良好的催化酰化/去酰化特性，因此在医药工业中发挥着重要的作用，主要应用于半合成青霉素和头孢菌素类的工业生产，可以催化制备高效、广谱、适用于不同用途的新型β-内酰胺抗生素。尽管青霉素酰化酶的研究已取得重要进展，但基础性的深入研究和大规模工业生产应用所需的优良酶类仍然缺乏，以及青霉素酰化酶的异源表达量较低也成为该酶产业化应用的瓶颈，因此筛选性能优越的青霉素酰化酶产生菌，探讨青霉素酰化酶的高效表达策略，对酶法合成β-内酰胺类抗生素具有重要意义。 本实验以10％(V/V)青霉素G溶液(107U/mL)为筛选压力，从药厂周围土壤等样品中筛选到耐高浓度青霉素微生物92株，扩展了本实验室微生物菌库。经过青霉素酰化酶底物类似物2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)复筛，获得一株青霉素酰化酶产生菌株PX03。根据16S rDNA序列分析，该菌株被鉴定为Escherichia coli，命名为Escherichia coli PX03。 以常用质粒pET28a(+)为表达载体，成功构建了含青霉素酰化酶PGApx03基因的诱导型表达载体pET-28a/pgapx03，将其导入宿主大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，酶活可达95.5U/L，重组酶经SDS-PAGE检测表明其在表达时形成了大量包涵体。 通过单因素实验来优化培养基，分别探讨了温度、诱导剂及其浓度、Ca2+及其浓度、L-阿拉伯糖对酶可溶性表达的影响，优化后的最适条件为:温度16℃，IPTG浓度0.03mM，Ca2+浓度10mM，L-阿拉伯糖浓度30g/L，诱导时间24h，优化后最大酶活可达21140 U/L，比活为2350 U/(L·OD660)，相比于初始酶活提高了221倍，比活提高了76倍，表达水平超过目前文献报道的表达水平，使其更有利于实际应用与开发。 初步探索了青霉素酰化酶PGApx03在头孢羟氨苄合成中的研究。在30％(V/V)丙三醇-磷酸盐缓冲(pH6.5)溶剂体系中，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)浓度为30mmol/L，侧链对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPGM)和7-ADCA的浓度比为2∶1，重组青霉素酰化酶700U/mmo17-ADCA，在20℃，180rpm条件下，反应8h，体现了一定的头孢羟氨苄合成能力。这为进一步开发β-内酰胺类抗生素合成酶奠定了基础。 重新构建了蛋白C端含有6个组氨酸标签的青霉素酰化酶表达载体His-pET28a/pgapx03，通过组氨酸标签蛋白纯化的方法，一步纯化获得高纯的青霉素酰化酶，为以后的蛋白结晶或者固定化等研究奠定了基础。 本研究通过自行筛选获得一株具有自主知识产权的青霉素酰化酶产生菌Escherichia coli PX03。通过表达策略的研究，重组青霉素酰化酶PGApx03已在大肠杆菌BL21中过量表达，同时重组青霉素酰化酶PGApx03对头孢羟氨苄具有良好的合成效率，最后通过组氨酸纯化的方法，一步获得高纯的青霉素酰化酶。