传统观念认为，精子是个高度分化的终末细胞，仅仅将父本基因组传递给卵细胞。但近年来的研究证实哺乳动物精子中存在有复杂的mRNA，基因芯片方法在人的成熟精子中检测出大约3500-5500种的mRNA。我们实验室用基因序列分析(SAGE)的方法也对人成熟精子中的mRNA进行了聚类和功能分析。其中在389高丰度表达的基因中，最突出的是一组核蛋白基因，占全部聚类分析基因的四分之一(96/389)，主要参与DNA依赖的基因转录和翻译调节。此外，还包括蛋白多肽溶解相关者、蛋白激酶、免疫相关者、蛋白转运和定位相关者、翻译后修饰相关者、线粒体电子传递相关者、ATP合成传递相关者ATP、ATPase活性相关者、蛋白质向核内运输传递相关者等。另外，还发现54个重叠性标签没有基因匹配，属于未知的新基因。　　 为何转录静止的精子细胞有选择性地保留种类繁多的mRNA，这些mRNA又执行怎样的功能呢？研究人员发现精子中的mRNA在受精过程中会传递给卵子且持续存在，从而推测其可能在受精和胚胎早期发育中具有重要作用。而以往的母系效应观点认为，在胚胎基因组激活前，合子发育由卵子发生过程中储存在成熟卵母细胞质中的母源因子（包括mRNA和蛋白质）所调控。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，这些母源因子启动早期胚胎发育，基因组开始转录，表达新的基因和合成新的因子，并发生级联反应，合成更多的细胞因子，保持早期胚胎继续发育。精子mRNA群进入合子中是否也同样起着类似的功能，起着调控胚胎的早期发育作用？这种父源因子的调控效应是否可能在胚胎发育中与母系效应互相补充，融为一体共同调控胚胎早期发育？为了探究精子中的mRNA的功能，本研究在已有人的精子mRNASAGE数据库基础上，首先试图从54个未匹配SAGE标签克隆出所对应的新基因，进而研究这些新基因的功能，分析这些功能在精子发生及胚胎早期发育过程中的作用。本研究可分为两个部分:　　 第一部分研究，为了便于从SAGE标签克隆出对应新基因序列，我们研究创建了一种薪的克隆方法。基因序列分析(SAGE)技术是一种高通量研究转录本的方法，通过定义每种mRNA特定位置的14bp长度的核苷酸片段(SAGE标签)可以系统，综合全面的构建出整个的表达谱。但同时由于SAGE标签仅有14bp碱基，承载有限的遗传信息，因此需要克隆标签所代表的基因全长序列，以便研究其功能。常规的3和5RACE方法都无法从14bp的短标签克隆其cDNA的全长，因而出现了一些特殊的方法如，RAST-PCR、GLGI、rSAGE等方法。这些方法各有所长，但都存在费时费力，克隆效率低，易产生非特异性条带，尤其需要很高的初始mRNA模板量。本研究中，精子中的mRNA含量非常少，仅有体细胞的1/600，因此很难用上述方法克隆其标签。为此，我们创建了新两步克隆方法，第一步骤是模板cDNAs的富集。利用夹在所有cDNAs两端序列为引物，经过PCR可以富集扩增出总cDNAs模板;第二步骤利用上述模板进行含tag的特异性片段克隆。根据半巢式PCR原理设计成2条下游套式引物，结合上游含标签特异性引物采用两次半巢氏PCR扩增出目的片度。与同类方法比较而言，本研究方法扩增特异性高，所需初始mRNA模板量少，尤其克隆一些低丰度表达的基因效果好。用此方法，我们对54个中11未知标签进行其3cDNA端克隆，并成功得到了11个标签对应的3cDNA长片段，便于后续基因全长的克隆及分析。　　 第二部分研究，利用上述创新的方法并结合5RACE等方法，从54个未知标签中成功克隆出一个基因。该序列在NCBI人的refseq_rna库未见匹配的同源序列，根据人类基因命名的规则初步命名该新基因为QSA。通过生物信息学分析，我们发现该基因由人第19号染色体上三个外显子拼接而成，物种之间同源性较低，但编码28aa蛋白质序列在物种之间具有非常高的保守性，且含有一段signalanchor信号序列。利用RT-PCR及原位杂交分析基因QSA的mRNA时空表达分布发现，该基因在24种人组织切片中部分腺体组织（如:甲状旁腺、垂体、前列腺等）中具有明显的表达;另外，睾丸、精子、受精卵中也检测出基因QSA的表达，而在卵细胞及囊胚均未见基因QSA的mRNA。同时，我们原核表达了抗原多肽QSA，并以此免疫兔产生抗多肽QSA的抗体。根据原位杂交结果，我们选择了部分组织利用Western-blot，免疫组化及间接免疫荧光实验检测了基因QSA的表达蛋白分布。该蛋白的分布情况与原位杂交结果一致，特别在睾丸组织中，主要分布在各级生精细胞中，而其他支持细胞、间质细胞中均未见。为了研究与蛋白QSA发生结合作用的蛋白，我们做了人的16，000种类蛋白点阵的蛋白芯片分析，发现核糖核酸酶P/MRP的可变亚基蛋白前体4(POP4)与待测蛋白QSA具有很强的结合信号。　　 结合上述实验结果，我们初步得出如下结论:我们改进了一种新的分子克隆方法，可以便捷、特异性从SAGE标签克隆出基因全长序列，尤其克隆一些低丰度表达的标签特异性较同类方法高。我们用此方法成功地从人精子mRNASAGE库中克隆出新基因QSA。该基因QSA的核酸和蛋白在进化过程中保守性的差异，说明基因QSA在分子进化水平上突变属于无害突变，不影响蛋白序生物功能性质;遵循分子中性进化理论，即在生物分子层次上的进化改变不是由自然选择作用于有利突变而引起的，而是在连续的突变压之下由选择中性或非常接近中性的突变的随机固定造成的（这里所谓选择中性的突变是指对当前适应度无影响的突变）。由于含有signalanchor信号序列，蛋白QSA可能为膜蛋白。同时，新基因QSA表达分布于部分腺体组织细胞，以及睾丸、精子、受精卵中。蛋白芯片实验揭示蛋白前体4(POP4)与蛋白QSA发生结合作用。POP4为核糖核酸酶P/MRP一个可变亚基。核糖核酸酶P对于正常并有效地转录多种非编码RNA(包括tRNA、5SrRNA、SRPRNA和U6snRNA)的基因是必要的。　　 我们根据上述结论做出推论，基因QSA在部分腺体组织和睾丸各级生精细胞及受精卵中表达，推测基因QSA可能具体某种激素产生、分泌等有关且可能参与精子发生及胚胎的早期发育过程。潜在的途径可能是蛋白QSA可能位于核膜上，介导POP4组装成核糖核酸酶参与激素的合成、分泌等过程，从而通过激素发挥在精子发生及胚胎发育过程中的作用。因而，推测精子的mRNA在胚胎的早期发育过程中可能产生父系效应。