第一部分吡格列酮抗抑郁作用的代谢组学研究及氧化应激验证目的:探讨LPS诱导小鼠抑郁模型中的病理生理学改变,并且通过结合行为学实验、代谢轮廓分析及氧化应激相关指标检测,揭示PPAR-γ激动剂PIO抗抑郁作用的可能机制。方法:48只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,20-25g)单笼饲养于室温22±2°C,12h昼夜节律(早上8点开灯),自由摄食水。在适应性喂养一周、基线行为学测定(OFT,FST以及SPT)后,小鼠被随机分为三组:(1)LPS组,接受LPS(1μL/只,i.c.v.)、NS(20 mL/kg,i.g.)处理;(2)LPS+PIO组,接受LPS(1μL/只,i.c.v.)、PIO(20mL/kg,i.g.)处理;(3)对照组,接受NS(1μL/只,i.c.v.)、NS(20 mL/kg,i.g.)处理。LPS(血清型0127:B8)和PIO分别以10ng/μL和1 mg/mL的浓度溶于NS。在LPS或NS侧脑室注射的2h前实行PIO或NS的灌胃处理。术后即刻称量体重,并且进行术后24h内的SPT,随后进行24h后的OFT以及FST。当行为学实验(n=14/组)结束后,立即处死小鼠、取出脑组织、分离海马用于进一步的代谢轮廓分析(n=10只/组)、WB检测(n=4只/组)。每组中2只小鼠接受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用GC-MS技术进行三组中小鼠海马组织的代谢轮廓分析。运用多元统计分析,包括PCA、PLS-DA和OPLS-DA进行差异代谢物的鉴定。此外,采用7次循环交互验证和200次响应排序的RPT对OPLS-DA模型进行考察。OPLS-DA中变量的重要性用VIP法评价。运用IPA进行差异代谢物的相关分析,基于Ingenuity Knowledge Base数据库中的信息,鉴定最具代表性的经典通路和分子互作网络。根据代谢轮廓分析的结果,采用WB分析进行小鼠海马内氧化应激相关指标的进一步验证。结果:1.PIO对接受中枢炎性应激小鼠行为学改变的影响:中枢LPS注射诱导小鼠抑郁样行为,包括快感缺失、行为绝望(表现为SPT中糖水偏好的下降、FST中不动时间的延长);同时伴有焦虑样行为(表现为OFT中中心活动距离的下降)以及急性病样反应,包括探索性活动、自主活动的降低(表现为OFT中直立次数、总活动距离的下降),这些改变被PIO预处理不同程度地逆转。然而,作为急性病样反应中负能量平衡的结果,PIO预处理未能改变体重的降低。总之,这些结果表明PIO预处理可逆转侧脑室LPS注射诱导的小鼠抑郁样、焦虑样行为以及某些急性病样反应。2.基于GC-MS的小鼠海马代谢轮廓分析:(1)在TIC色谱图中的色谱峰代表相应的代谢物,并且通过峰面积归一化法确定他们的相对浓度。本研究中,三组海马组织代表性TIC色谱图的分析信号强,峰容量大,R.T.重现性好。每组中初步检测到229个代谢物,这些代谢物对应的浓度被用于后续的多元统计分析。在PCA得分图中,R~2X>0.5,表明三组之间可明显区分(R~2X=0.609,Q~2=0.213)。在PLS-DA得分图中,这三个比较集中也有明显的区分,包括LPS与对照组之间(R~2X=0.421,R~2Y=0.997,Q~2=0.874),LPS+PIO与LPS组之间(R~2X=0.233,R~2Y=0.959,Q~2=0.564),以及LPS+PIO与对照组之间(R~2X=0.397,R~2Y=0.989,Q~2=0.938)。此外,用于差异最大化的OPLS-DA模型显示三个比较集中的显著区分,包括LPS与对照组之间(R~2X=0.421,R~2Y=0.997,Q~2=0.864),LPS+PIO与LPS组之间(R~2X=0.233,R~2Y=0.959,Q~2=0.627),以及LPS+PIO与对照组之间(R~2X=0.397,R~2Y=0.989,Q~2=0.936)。由于PLS-DA、OPLS-DA中的关键参数Q~2均>0.5,说明模型稳健、有良好的拟合度和预测性。RPT被用来评估OPLS-DA模型,其中原始的R~2,Q~2值显著高于对应的置换值,并且所有的Q~2均<0,说明OPLS-DA模型稳健、没有过度拟合(分别为R~2=0.708,Q~2=–0.492;R~2=0.786,Q~2=–0.293;R~2=0.6,Q~2=–0.471)。(2)通过OPLS-DA模型中VIP>1以及Bonferroni-或Dunnett-校正的P值<0.05,三个比较集中总共鉴定出52个差异代谢物。他们主要参与氨基酸、能量和核苷酸(嘌呤、嘧啶)代谢。在这52个代谢物中,从三个比较集中分别鉴定出41,15和35个差异代谢物(LPS与对照组之间;LPS+PIO与LPS组之间;LPS+PIO与对照组之间),它们被认为分别与炎症相关抑郁症的发生、PIO的作用,以及上述两个因素之间的相互作用潜在相关。运用IPA分析出三个比较集中的五大最受影响经典通路及改变最显著的互作网络。此外,基于这些代谢物的生化联系,整合包含最多差异代谢物的通路、构建出整体概要图,该概要图提示包含多数差异代谢物的神经传递、能量代谢、氧化应激过程可能参与炎症相关抑郁症的发病机制及PIO的抗抑郁作用。3.小鼠海马内氧化应激相关指标的检测:除神经传递外,GSH代谢通路是LPS+PIO组与LPS组比较中干扰最显著的通路;此外,IPA互作网络分析预测与抗氧化过程有关的SOD、MPO可能与PIO的作用有关。在本研究中,相比于对照组,LPS组中发现氧化应激的活化,表现为促氧化的NOX亚基gp91phox,p47phox的上调,抗氧化的SOD1、GPX1的下调。然而,相比于LPS组,这种失衡在LPS+PIO组中被不同程度逆转,与代谢的结果一致。这些结果提示PIO预处理有效缓解中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁模型中促氧化/抗氧化状态的失衡。结论:本研究证实了PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑行为,以及某些急性病样反应中的有益作用。基于GC-MS的三组间代谢轮廓分析发现了氨基酸代谢,能量代谢以及核苷酸代谢的扰动,提示相关的神经传递、能量代谢、氧化应激的扰动可能(至少部分)参与炎症相关抑郁症的发病机制,并且PPAR-γ激动剂可能通过对这些过程的扰动产生抗抑郁作用。此外,WB验证进一步明确了氧化应激的改变。本研究为炎症相关抑郁症的发病机制,以及PPAR-γ激动剂在其中发挥抗抑郁作用的分子机制提供新见解,同时可能为伴随免疫活化的抑郁症患者的治疗提供新靶点。第二部分吡格列酮抗抑郁作用的相关信号通路蛋白检测目的:应用PPAR-γ激动剂PIO与拮抗剂GW9662评价PPAR-γ活化在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样行为中的有益作用,进行相关信号通路蛋白检测,进一步探索其作用机制。方法:45只雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄,18-22g)单笼饲养于室温22±2°C,12h昼夜节律(早上8点开灯),自由摄食水。在基线时,进行OFT、FST,随后经过5天的适应期,期间训练小鼠适应盛清水的双饮水瓶存在,随后进行SPT。需要注意的是,与实验I相比,提前进行OFT与FST,以避免由于术前、术后检测时间间隔短而造成的潜在影响。在基线行为学评估后,将小鼠随机分为4组:(1)对照组(NS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(2)LPS组(LPS,i.c.v.;NS,i.g.;NS,i.p.);(3)LPS+PIO组(LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;NS,i.p.);(4)LPS+PIO+GW9662组(LPS,i.c.v.;PIO,i.g.;GW9662,i.p.)。LPS(血清型0127:B8),PIO和GW9662分别以10 ng/μL,1mg/mL和2 mg/mL的浓度溶于NS,并且体积分别为1μL/只,20 mL/kg,1 mL/kg。在脑立体定位手术前2h和30min分别给予PIO(或NS)和GW9662(或NS)处理。随后,小鼠接受LSP(或NS)中枢注射。术后的操作流程,包括体重测量、行为学检测、样本采集同实验I(n=9-10)。每组中2只小鼠接受溴酚蓝染液注射以确保注射位置的准确性。采用WB技术进行小鼠海马内相关信号通路及蛋白的检测,包括JAK2/STAT3通路、CREB/BDNF通路及其下游效应分子,以及5-HT1AR(n=6)。结果:1.PPAR-γ活化对中枢炎性应激诱导的小鼠行为学改变的影响:如实验I,侧脑室LPS注射诱导小鼠出现快感缺失、行为绝望-抑郁症的核心症状;以及焦虑样行为和急性病样反应,包括体重下降,探索性活动、自主活动的降低(LPS组vs.对照组)。除了体重下降之外,PIO可不同程度地逆转这些表型改变(LPS+PIO组vs.LPS组),PIO的这种改善作用被GW9662阻断(LPS+PIO+GW9662组vs.LPS+PIO组;LPS+PIO+GW9662组vs.对照组)。PIO、GW9662的预处理对中枢LPS注射诱导的体重下降无影响。总之,这些结果显示PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样、焦虑样行为及某些急性病样反应中发挥PPAR-γ依赖性的有益作用。2、小鼠海马内相关信号通路及蛋白检测:(1)为了检测PIO是否通过激活PPAR-γ,经特定的信号通路发挥抗抑郁作用,我们检测了小鼠海马内PPAR-γ的水平,以及与炎症诱导抑郁样行为有关的蛋白激酶,包括JAK2,STAT3的表达。中枢LPS刺激后出现PPAR-γ的显著降低(LPS组vs.对照组),这种降低被PIO预处理逆转(LPS+PIO组vs.LPS组),该PIO效应被GW9662阻断(LPS+PIO+GW9662组vs.LPS+PIO组,LPS+PIO+GW9662组vs.对照组)。(2)中枢LPS刺激后,促炎细胞因子IL-6表达升高,其下游JAK2/STAT3信号通路活化,表现为磷酸化JAK2/总JAK2(p-JAK2/t-JAK2),p-STAT3/t-STAT3的比值上调。有趣的是,PIO预处理抑制了这些改变,而这种抑制效应被GW9662阻断。(3)作为炎症状态下JAK2/STAT3通路重要的下游效应分子,我们发现中枢LPS刺激后出现的IDO1表达增高被PIO预处理显著逆转,该逆转效应被GW9662阻断。(4)接受LPS注射的小鼠脑中5-HT1AR表达显著低于对照组小鼠。PIO预处理逆转5-HT1AR的下调(LPS+PIO组vs.LPS组),但未能使其恢复至正常水平(LPS+PIO组vs.对照组),GW9662阻断PIO的该种效应。作为可被炎症诱导、介导5-HT前体色氨酸沿犬尿氨酸通路降解的限速酶,IDO1的活化引起色氨酸分解代谢的增加,可很好地解释抑郁症中5-HT合成的降低,以及中枢5-HT能神经传递的障碍。此外,5-HT1AR可通过结合5-HT参与中枢5-HT能神经传递。我们关于IDO1、5-HT1AR的发现提供了一种可能性:PPAR-γ的活化可能对中枢5-HT能神经传递产生潜在影响,这种效应也可能参与PIO在该模型中的有益作用。(5)本研究中,我们还检测了神经营养相关CREB/BDNF通路,以及下游的突触可塑性相关蛋白。中枢LPS刺激后,小鼠脑内出现p-CREB/t-CREB比例,以及BDNF表达的显著下调,这些下调被PIO预处理明显逆转;此外,突触可塑性相关蛋白,包括SYNI,GAP-43和PSD-95,可介导BDNF的神经营养效应,也被作为CREB/BDNF的下游效应分子在本研究中被评估。与对照组相比,给予中枢LPS刺激的小鼠表现出SYN1,GAP-43以及PSD-95表达的显著下降,同样,PIO预处理不同程度地缓解了这种改变。以上PIO对CREB/BDNF及下游效应分子下调的改善作用均被GW9662明显阻断。结论:我们的结果明确了PIO在中枢炎性应激诱导的小鼠抑郁样行为,以及某些急性病样反应和焦虑样行为中PPAR-γ依赖性的有益作用。WB分析提示对JAK2/STAT3和CREB/BDNF通路的调节以及对中枢5-HT能神经传递的潜在影响,可能参与PIO在中枢炎性应激诱导的抑郁样行为中PPAR-γ-依赖性的有益作用。