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为探明中国水仙花(Narcissus tazetta var.Cihensis Roem)类黄酮物质组分与代谢机制,本研究以中国水仙花不同发育阶段的花瓣和副冠为材料,利用非酸水解法提取类黄酮物质,结合HPLC-MSn技术,对不同发育时期的中国水仙花类黄酮物质进行定性定量分析,同时采用表达谱分析和荧光定量PCR分析,对其类黄酮合成途径进行研究,得到的主要结果如下:1建立了中国水仙花类黄酮物质提取与鉴定技术以中国水仙三年生种球盛花期花瓣为材料,比较非酸水解法和酸水解法提取得到的类黄酮物质,并用高效液相色谱与多级质谱联用(HPLC-MSn)技术进行鉴定,比较了两种提取方法的优缺点、筛选了 HPLC-MSn的流动相体系。结果表明,在同一 HPLC-MSn流动相体系及梯度洗脱条件下酸水解法提取鉴定得到了绿原酸、槲皮素和异鼠李素;非酸水解法提取鉴定得到了绿原酸、芦丁和水仙苷。槲皮素和异鼠李素分别是芦丁和水仙苷的苷元,鉴于非酸水解法提取得到的黄酮苷经HPLC-MSm技术鉴定能提供更丰富的结构信息(糖苷键结合位置、糖苷种类),所以选择非酸解法为后续试验的提取方法。比较了 1%乙酸-甲醇和1%乙酸-乙睛作为流动相体系在同等提取方法和梯度洗脱条件下的峰型和物质出峰的保留时间,1%乙酸-乙睛的流动相体系表现更好。2确定了中国水仙花中的主要类黄酮物质成分及其在花发育过程中的含量变化采用HPLC-MSn对不同时期中国水仙花绿原酸、芦丁、水仙苷在副冠和花瓣的含量进行定量分析。结果表明,在佛焰总苞初期和佛焰总苞中期雄蕊均没有检测到三种成分。随着花的开放,绿原酸的含量在绿苞期花瓣中最高,随后逐渐减小,花瓣中的绿原酸含量均高于副冠。芦丁的含量在绿苞期最高,副冠的含量略高于花瓣,盛花期花瓣的芦丁含量高于副冠。水仙苷也呈现类似的趋势,在绿苞期最高,副冠含量高于花瓣,盛花期花瓣含量高于副冠。在同一时期相同物质的比较中,水仙苷含量>芦丁含量>绿原酸含量。3构建了中国水仙花色发育过程的表达谱并筛选了类黄酮合成途径中的差异基因构建了中国水仙花色发育过程的数字化表达谱,碱基质量值分析结果表明,碱基平均质量值分布大部分在30～40之间(Q30～Q40),即测序识别错误率在0.1%～0.01%之间。对测序产出进行统计:一共得到了 68.79Mreads,总碱基数为3.49G。在测序质量值统计评估方面,碱基Q30都在85%以上。与参考基因组的比对发现,7个样品的reads与参考基因组的比对效率较高,均在76%以上,表明测序及所选参考基因较好,满足后续分析的需要。经DNA随机性检验,中国水仙花色发育各时期样品对应的分布曲线比较平缓,表明各样品的整体测序随机性较好。在KEGG注释得到了两条与类黄酮代谢相关的通路,分别为类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis,ko00941),黄酮与黄酮醇生物合成(Flavone and flavonolbiosynthesis,ko00944)。对不同发育时期的样品间进行两两比对,共筛选出差异表达基因13个,其中,类黄酮生物合成途径10个,分别属于:CHS、CCoAOMT、F3’H、C4H、HCT、C3’H。黄酮与黄酮醇生物合成途径4个,分别属于F3-OMT、F3’H。用BLAST软件对差异表达基因序列与Nr,Swiss-Prot,GO,COG,KEGG数据库进行比对,获得差异基因的注释信息4利用荧光定量PCR技术研究了差异表达基因在花发育过程中的表达规律以佛焰总苞期初期(E0)各基因的表达量为对照,比较中国水仙花瓣在类黄酮、黄酮和黄酮醇途径中差异基因在不同时期的表达:F3’H、F3-OMT-1表达量逐渐下降,F3-OMT-2、F3-OMT-3、C4H、CHS、CCoAOMT-3表达量先上升,在佛焰总苞中期花瓣(E01-2)中表达量最高,随后降低,C3’H、CCoAOMT-1、CCoAOMT-2表达量逐步上升。比较中国水仙副冠类黄酮、黄酮和黄酮醇途径中差异基因在不同时期的表达情况,F3-OMT-1、F3-OMT-2、F3-OMT-3表达量逐渐下降,F3’H、CHS表达量先上升,在绿苞期副冠(E03)中表达量最高,随后降低,C3’H、CCoAOMT-1、CCoA OMT-2表达量逐步上升。CCoAOMT-3表达量总体呈现上升态势,在绿苞期花冠(E03)表达量最低。以佛焰总苞期雄蕊(E01-1)各基因的表达量为对照,比较中国水仙花雄蕊、花瓣类黄酮、黄酮和黄酮醇途径中在佛焰总苞中期的差异基因的表达情况,F3’H、F3-OMT-1、F3-OMT-2、F3-OMT-3、C3’H、CCoA OMT-3、表达量雄蕊高于花瓣,C4H、CHSCCoAOMT-1、CCoA OMT-2表达量花瓣高于雄蕊。以绿苞期花瓣(E02)各基因的表达量为对照,比较中国水仙花瓣、副冠类黄酮、黄酮和黄酮醇途径中差异基因在绿苞期的表达情况,F3’H、F3-OMT-1、F3-OMT-2、F3-OMT-3、CCoA OMT-1、CCoAOMT-2表达量花瓣高于副冠,C4H、CHS、CCoAOMT-3表达量副冠高于花瓣。C3’H基因在两部位中表达量无显著差异。以盛花期花瓣(E04)各基因的表达量为对照,比较中国水仙花瓣、副冠类黄酮、黄酮和黄酮醇途径中差异基因在盛花期的表达情况,F3’H、F3-OMT-3、CHS、CCoA OMT-1 表达量花瓣高于副冠,F3-OMT-1、F3-OMT-2、C3’H、C4H、CCoAOMT-2、CCoAOMT-3表达量副冠高于花瓣。CHS、F3’H、F3-OMT表达量的变化总体呈现在盛花期前积累,盛花期降低的趋势,与芦丁、水仙苷在中国水仙发育过程中的变化规律相一致,其中F3-OMT能特异识别芦丁为底物甲基化形成水仙苷,改变原物质化学活性,在结构上更稳定。水仙苷在盛花期前大量积累与花青素共同争夺共同的底物二氢槲皮素,抑制了花青素的合成,可能是中国水仙花中未能检测到花青素存在的原因。