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禽呼肠孤病毒感染（Avian reovirus infection）是由禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）引起的，主要引起雏鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎，此外还与鸡的呼吸道病、肠道病、肉鸡矮小综合征、暂时性消化系统紊乱和吸收障碍综合征等病症有一定的联系，是一类危害较为严重的禽免疫抑制病。为了进行ARV亚单位疫苗的探索，本次研究根据已公布的ARV S1133病毒基因组序列设计扩增引物，以从感染ARV S1133病毒的鸡胚尿囊液中提取的病毒RNA反转录的cDNA为模板扩增σC基因，将σC基因克隆至pPIC9K酵母表达载体当中，构建pPIC9K-σC重组表达质粒。将pPIC9K-σC重组表达质粒中提后用SalⅠ酶切线性化，电转化毕赤酵母宿主菌GS115，经MD平板及YPD G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定，获得重组酵母菌株pPIC9K-σC/GS115。对阳性重组菌进行小量诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、Western-blot分析，结果表明σC蛋白在毕赤酵母中获得分泌表达，表达产物以单体和三聚体形式存在，与兔源σC多克隆抗体及病毒多抗有良好的反应活性，分泌表达量达到42mg/L。为了进一步提高σC重组蛋白的表达量，本研究从宿主菌，插入基因拷贝数及发酵过程三个方面对ARV σC蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达条件进行了优化。宿主菌株上选择了KM71和GS115进行了MutS和Mut+表型表达量之间的比较；拷贝数上对增加拷贝数是否对基因的表达量有所提高进行了探索，构建了pPICZαC-σC重组表达质粒，转化已构建好的pPIC9K-σC/GS115宿主菌，经过Zeocin抗性筛选获得了pPIC9K-ZαC-σC/GS115宿主菌，与pPIC9K-σC/GS115宿主菌进行了表达量的对比；在表达条件上对发酵过程中的温度、pH进行了初步的探索。结果显示GS115宿主菌株的表达量普遍高于KM71宿主菌株，说明Mut+表型更利于蛋白的表达；pPIC9K-ZαC-σC/GS115宿主菌的表达量高于pPIC9K-σC/GS115宿主菌的表达量，说明提高基因的拷贝数有利于σC蛋白的表达；对发酵条件的优化结果显示在发酵过程中菌株的最佳表达温度为30℃，最佳pH值为7.0。优化后的σC重组蛋白的表达量达到540mg/L，为ARV σC蛋白的工业化大规模发酵奠定了基础。将毕赤酵母表达的重组σC蛋白用法国佐剂乳化后，以80μg/只肌肉注射3周龄SPF鸡，四周后进行二免，每周采集血清检测抗体滴度。结果表明，抗体水平于二免后迅速升高，二免后2周达到高峰，抗体阳性率为87.5%，二免后第2周至二免后17周平均抗体滴度在5000至7000之间，未见有明显下降。血清中和试验表明免疫之后的血清能够中和病毒，中和效价能够达到1:1000。一免后四周的攻毒试验表明σC蛋白可以阻止ARV在体内的复制，且能够对感染病毒进行清除。综上所述，本研究将ARV σC蛋白在毕赤酵母中进行了分泌表达，表达产物免疫原性良好，可以诱导机体产生保护性免疫反应，为ARV的诊断试剂和亚单位疫苗的研制奠定了基础。