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鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)血清1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)均为危害养鸭业发展的重要病毒性病原,为了快速检测这几种病毒。本研究建立了DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的一步法多重RTPCR检测方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性等要素进行评估,并将建立的方法应用于病料的鉴别诊断,结果如下:1.DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3一步法多重RT-PCR检测方法的建立根据DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3在GenBank上全基因组保守序列设计四对引物,以4种病毒的核酸为模板,通过对反应退火温度和引物浓度等条件进行优化,建立了一步法多重RT-PCR方法,分别能扩增出322bp、804bp、648bp和1314bp的目的片段。特异性试验结果显示:以鸭乙肝病毒、禽流感病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和健康鸭脾脏组织为模板的扩增结果均为阴性。对同一批次的阳性样本三次重复检测的结果一致。敏感性试验结果显示:DTMUV、DHAV-1和DHAV-3最低检出限均为0.1pg,DPV最低检测限为1pg,而同一体系中同时检测出DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3四种病毒的最低检测限为1pg。2.建立的一步法多重RT-PCR样品检测的应用选择上述病毒对无母源抗体7日龄健康雏鸭攻毒模拟混合感染,采集脾脏和法氏囊共108份样品,采用建立的一步法多重RT-PCR方法和经典的其他PCR方法检测结果显示:对于DTMUV、DPV、DHAV-1和DHAV-3的检测结果阳性符合率分别为98.3%、100%、96.7%和97.4%,阴性符合率分别为87.5%、100%、97.4%和95.7%,也表明了建立的方法可信度高。应用该方法对67例广汉、什邡、德阳、邛崃、眉山、绵阳、乐山、简阳及云南等地送检样品进行检测,结果显示:检出DHAV-1和DTMUV阳性病料分别为16份、4份,检出率分别为23.9%、6.0%,均未见混合阳性样品检出,且DPV和DHAV-3检测结果均为阴性。