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近年来全世界许多海域出现了浮游动物水母暴发的问题,水母的反复暴发对于游客、海水浴者尤其是海洋从业人员存在着健康和经济方面的严重威胁。水母属于刺胞动物门,包括整个钵水母纲以及水螅虫纲的少数种类,共约300余种,其中对人类有害的约100种。水母的身体呈伞状,体型大小相去甚远,水母触手布满刺丝囊,一旦受激便高速发射带有倒钩的刺丝进入猎物体内并注毒,导致蜇伤。不同种属水母的刺丝囊有着较大的差异,同一种水母的刺丝囊也形态多样,在水母的进化、生存等方面承担着不同的作用。刺丝囊内毒液主要由蛋白和肽类毒素构成,通常水母蜇伤仅造成局部症状,但心血管、溶血和神经并发症也时有发生。目前尚无单一蛋白成分的腔肠动物心血管毒素报道,关于溶血毒素的报道主要来自对栖底生物的研究,如海葵、珊瑚虫,近年来在几种管水母,方水母,钵水母中同样发现了溶血毒素,且这些营浮游生活的水母与人类蜇伤更为相关。研究目的:本课题的研究对象为中国东南海域水母暴发的主要大型品种——发形霞水母(Cyanea capillata)与越前水母(Nemopilema nomurai)。为深入了解这两种水母刺丝囊毒素蛋白的活性与蜇伤机理,首先分离鉴别其未发射刺丝囊及同种水母单型刺丝囊,继而获得刺丝囊毒素蛋白,分析比较不同类型刺丝囊毒素的心血管活性和溶血活性,并以活性为导向,对水母刺丝囊毒素蛋白进行分离纯化。研究方法:1、发形霞水母及越前水母刺丝囊的制备:建立抑制刺丝囊发射的制备体系,利用水母组织与刺丝囊,以及单型刺丝囊之间大小、密度、沉降系数的不同,通过分级过筛、密度梯度离心的方法,制备保留生物活性的水母未发射刺丝囊。2、水母刺丝囊毒素蛋白获取,活性检测和定位:低温超声破碎法获取水母刺丝囊毒素蛋白。通过大鼠血压监测,溶血活性测定法评价比较东海大型水母刺丝囊毒性,以及越前水母两种单型刺丝囊的毒素活性,确定心血管活性和溶血活性存在的位置。3、越前水母刺丝囊心血管和溶血活性蛋白的定向纯化:利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析,结合MALDI-TOF质谱分析,对越前水母刺丝囊毒素(Nemopilema nomurainematocyst venom,NNV)进行分离纯化,并筛选其中具有心血管活性和溶血活性的组分。实验结果:1、本实验成功制备了大量纯净未发射的水母刺丝囊及单型刺丝囊。经鉴定,我国东海海域的发形霞水母触手包含的刺丝囊有:(1)b-长棒型中轴穿刺丝囊(2)多倒刺哑铃型中轴穿刺丝囊(3)紧密刺丝等直径型钩刺丝囊(4)松散刺丝等直径型钩刺丝囊;越前水母触手包含的刺丝囊有:(1)松散刺丝等直径型钩刺丝囊(2)多倒刺哑铃型中轴穿刺丝囊(3)紧密刺丝等直径型钩刺丝囊(4)刺丝渐细型钩刺丝囊。该方法制备的刺丝囊发射率低于1%,且基本保留生物活性,在渗透压改变时刺丝囊发射率达80%以上。2、本方法制备了不含水母自身组织杂质的水母刺丝囊毒素。NNV有强心血管致死活性和溶血活性,分别较发形霞水母刺丝囊毒素(Cyanea capillata nematocyst venom,CNV)强20-50倍和10-20倍。在越前水母刺丝囊(Nemopilema nomurai nematocyst,N3)中,松散刺丝等直径型钩刺丝囊毒素(O-isorhiza nematocyst venom,ONV)有强心血管致死活性,而刺丝渐细型钩刺丝囊毒素(Anisorhizas nematocyst venom,ANV)并无致死活性,ONV的溶血活性略高。3、通过对NNV凝胶纯化各组分的初筛,我们确定了心血管毒素F和溶血毒素D这两个组分。F组分的心血管致死活性明显高于NNV,约为NNV的5-10倍,且无溶血作用。D组分的溶血活性比NNV略低。结论:本研究首次依据对刺丝囊形态结构的描述对不同类型刺丝囊进行中文命名;通过分级沉降过滤,梯度密度离心的方法获得大量纯净未发射的水母刺丝囊及单型刺丝囊,进而获得不含组织杂质的水母刺丝囊毒素蛋白。相对于以往所制备毒素,本研究制备的纯刺丝囊毒素的心血管毒性和溶血毒性均大大提高,且毒性稳定。本研究重点优化了越前水母刺丝囊的分离技术,得到了两种越前水母单型刺丝囊Anisorhizas和O-isorhiza,通过对以上两种刺丝囊的活性检测,我们定位越前水母的心血管(致死)毒素主要存在于O-isorhiza中,两种刺丝囊均含有溶血毒素。证明O-isorhiza是越前水母触手具有主要攻击功能的刺丝囊。本研究还对越前水母毒素蛋白进行了初步分离纯化,得到了具有明确溶血活性和心血管活性的纯化组分,纯化组分电泳条带相对单一,性质稳定,可以用于下一步结构鉴定与机制研究。本课题组前期研究及其他文献报道都指出,水母毒素中穿孔机制可能是其造成溶血作用和心血管作用,甚至致死的原因。通过对越前水母单型刺丝囊毒素之间,以及纯化组分D与F之间的活性比较,联合电泳蛋白条带的分析,我们可以确定:虽然越前水母NNV的溶血活性可能致死动物,但严重的心血管致死效应与溶血效应这两者之间无关联性,是两类不同的蛋白造成了这两种毒性反应。由于心血管毒素F和溶血毒素D均为电泳检测含有3-4个条带的混合蛋白,有待更进一步的纯化实现完全分离,并进行结构鉴定和毒理学机制研究。通过凝胶和HPLC二次纯化我们得到了一个单一蛋白条带的组分E,但其并未表现出明显心血管活性和溶血活性,这一组分的活性和结构也有待下一步实验阐明。