背景发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),属布尼亚病毒科白蛉病毒属,是一种分节段的单股负链RNA病毒,基因组包括L、M和S三个片段。由SFTSV感染所致的疾病称为发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS),临床表现为发热、头痛、乏力、肌肉酸痛、全身不适、恶心和呕吐等,严重者出现多器官衰竭甚至死亡。SFTS流行于东亚,包括中国、日本和韩国。SFTS的病死率高达30%,平均约12%。SFTSV经蜱叮咬传播,也可通过接触病人血液和分泌物感染。蜱为吸血媒介,可被其吸食血液的动物分布广泛,但这些动物,特别是小型哺乳动物在SFTSV传播过程中的作用尚不明确。SFTSV可能起源于中国中部淮阳山区域,但病毒在中国、日本和韩国的传播路径尚不清楚。目前针对该疾病,既无特效药物,也无有效的疫苗可供使用,对患者主要采取广谱抗病毒治疗和对症支持治疗。针对危重患者,中和抗体治疗将是行之有效的方法。SFTS流行特征的解析、传播模式的探讨及抗体药物的研发,对丰富SFTS的病原学知识、流行病学理论、疾病的预防控制和诊断治疗具有重要意义。目的通过监测、分析自然状态下小型宿主动物SFTSV感染状况,探讨其在SFTSV传播过程中所起作用,为该病的预防控制提供理论依据;通过对SFTSV全基因组进行遗传进化分析,探讨SFTSV起源及可能传播路径,为SFTS的流行趋势预测提供重要线索;研究SFTSV人源单克隆抗体,为SFTS的特效治疗提供科学依据。方法1.动物标本采集及检测(1)2013年1月至8月,以山东省青岛市黄岛区胶南地区为调查点,捕获宿主动物,并对宿主动物进行种属鉴定,采集宿主动物脾脏、肝脏和心脏血标本。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测心脏血SFTSV总抗体。自宿主动物脾脏提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(reversed transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及巢式PCR扩增SFTSV M和S片段部分基因序列,并进行序列测定。测序结果运用NCBI-BLAST与数据库比对分析,判断其是否为SFTSV序列,并将所得到的SFTSV序列上传至NCBI数据库,获得GenBank号码。根据ELISA和PCR扩增结果,分别计算宿主动物SFTSV抗体阳性率和SFTSV带毒率,并综合抗体阳性率和宿主动物带毒率,计算宿主动物感染率。(2)将所得序列与自NCBI获得的参考株序列建立数据集,以Mega 5.0软件Clustal W程序进行比对,采用Neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型,构建系统发生树并进行自展信度检验。2.SFTSV遗传进化分析(1)从NCBI GenBank数据库搜索并下载SFTSV病毒株序列信息,明确每株病毒标本采集时间、地点。对病毒株的L、M和S片段序列进行系统发育分析,采用最大似然法(Maximum Likelihood Method)构建系统进化树。(2)利用基因重组预测软件 Recombination Detection Program version 3.44(RDP3)对病毒全基因组进行初步预测,确定可能的基因重配株。结合L、M和S片段序列系统发育分析中病毒株的分布,确定基因重配株。(3)基于贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛(Bayesian Markov chain Monte Carlo,MCMC)原理及分子钟模型,运用软件BEASTv1.8.0对病毒株的L、M、S片段序列及全基因组序列进行分析,确定病毒SFTSV的进化速率、分化时间及最近共同祖先(the most recent common ancestor,TMRCA)出现的时间。为检验病毒的进化速率是否是随机的,对序列信息进行随机化,用真实时间数据得出的进化速率和随机化的进化速率进行比较,从而确定病毒的进化速率是否是随机的。基于病毒重配和分化时间对病毒传播路径进行分析推测。3.SFTSV人源单克隆抗体制备及生物学功能研究(1)利用蛋白质跨膜区预测软件预测SFTSV糖蛋白跨膜序列,确定胞外区序列。构建包含SFTSV糖蛋白Gn和Gc胞外区的重组真核表达质粒,并表达纯化蛋白Gn、Gc。(2)从病人外周血中分离单个核细胞,采用流式细胞术分选针对SFTSV糖蛋白的记忆B细胞。RT-PCR、PCR扩增记忆B细胞中抗体可变区基因序列,重叠PCR法将抗体可变区与恒定区连接,构成抗体轻、重链全序列。将抗体轻、重链全序列克隆入真核表达载体,构建重组真核表达质粒。将包含抗体轻、重链全序列的重组真核表达质粒共转染哺乳动物细胞HEK293T,利用Western Blot初步筛选可以表达抗SFTSV Gn或Gc抗体的轻、重链质粒组合。对初步筛选到的抗体,利用ELISA、间接免疫荧光和空斑减少中和试验进一步研究抗体的蛋白结合活性、病毒结合活性和中和活性。结果1.捕获动物种属构成及感染状况(1)2013年1～8月,在山东省青岛市黄岛区胶南地区,共捕获小型哺乳动物774只,涵盖2目3科5属6种,包括褐家鼠(157只,20.3%)、小家鼠(183 只,23.6%)、大仓鼠(135 只,17.4%)、黑线姬鼠(188 只,24.3%)、黑线仓鼠(18只,2.3%)及鼩鼱(93只,12.0%)。户内捕获啮齿鼠类及鼩鼱376只,包括褐家鼠(151只,40.2%)、小家鼠(172只,45.7%)及鼩鼱(53只,14.1%)。野外捕获啮齿鼠类及鼩鼱398只,包括褐家鼠(6只,1.5%)、小家鼠(11只,2.8%)、大仓鼠(135只,33.9%)、黑线姬鼠(188只,47.2%)、黑线仓鼠(18只,4.5%)及鼩鼱(40只,10.1%)。(2)捕获的774只宿主动物中,共获得有效心脏血标本755份,包括156份褐家鼠标本、182份小家鼠标本、125份大仓鼠标本、186份黑线姬鼠标本、17份黑线仓鼠标本及89份鼩鼱标本。双抗原夹心ELISA检测,得到阳性标本9份,包括小家鼠标本2份、大仓鼠标本1份、黑线姬鼠标本2份、鼩鼱标本4份。宿主动物SFTSV抗体阳性率为1.2%,啮齿鼠类、鼩鼱的抗体阳性率分别为0.8%及4.5%。鼩鼱的抗体阳性率高于啮齿鼠类(P=0.014)。捕获的774只宿主动物中,共获得有效脾脏RNA标本517份,包括116份褐家鼠标本、103份小家鼠标本、83份大仓鼠标本、129份黑线姬鼠标本、9份黑线仓鼠标本及77份鼩鼱标本。经RT-PCR、巢式PCR检测,得到阳性标本5份,包括褐家鼠标本1份、小家鼠标本1份、大仓鼠标本1份、鼩鼱标本2份。宿主动物SFTSV RNA阳性率为1.0%,啮齿鼠类、鼩鼱的RNA阳性率分别为0.7%及2.6%,鼩鼱的RNA阳性率略高于啮齿鼠类,两者之间差异并不明显(P=0.162)。3月、6月的RNA阳性率分别为4.7%(4/86)、1.7%(1/62),其他月份未检测到SFTSV RNA,可以认为3、6月的RNA阳性率高于其他月份(P=0.043)。2013年1～8月间,共检测宿主动物标本755份,其中阳性标本14份,宿主动物的感染率为1.9%(14/755),啮齿鼠类的感染率为1.2%(8/666),鼩鼱的感染率为6.7%(6/89),鼩鼱的感染率高于啮齿鼠类(P=0.003),说明鼩鼱在SFTSV的传播中可能起更重要作用。户内宿主动物感染率为2.4%(9/372)、野外宿主动物感染率为1.3%(5/383),户内宿主动物感染率稍高于野外,差异不明显(P=0.291)。户内啮齿鼠类感染率为1.2%(4/321),户内鼩鼱感染率为9.8%(5/51),高于啮齿鼠类(P=0.003);野外啮齿鼠类感染率为1.2%(4/345),野外鼩鼱感染率为2.6%(1/38),稍高于野外啮齿鼠类,差异不明显(P=0.474)。啮齿鼠类户内、野外感染率基本无差别,而鼩鼱户内感染率明显高于野外(P=0.001),说明户内鼩鼱在SFTSV传播过程中起重要作用。2.遗传进化分析(1)从NCBI GenBank数据库中,我们得到符合条件的SFTSV病毒株122株,这些病毒株的时间跨度为2010年至2014年。122株病毒中,108株来自中国、8株来自日本、6株来自韩国。系统进化分析显示,122株病毒被分成5个主要分支,分别标记为A、B、C、D和E。(2)软件RDP4分析显示,共14株病毒可能为基因重配株,结合系统进化分析判断,6株病毒为基因重配株。LN2012-14、LN2012-34、LN2012-41和LN2012-42 的基因组成形式为 DAD,LN2012-58 为 DAA,AHL 为 EBD。(3)L片段、M片段、S片段、全基因组平均进化速率各不相同。L片段的进化速率为 4.16 E-4 s/s/y(substitutions per site per year)(95%HPD=8.99 E-5—9.72 E-4s/s/y),M 片段的进化速率为 6.76 E-4s/s/y(95%HPD=3,92 E-4—1.00 E-3 s/s/y),S 片段的进化速率为 1.09E-3 s/s/y(95%HPD= 5.43 E-4—1.60 E-3 s/s/y),全基因组平均进化速率为 6.73 E-4 s/s/y(95%HPD=2.35 E-4—1.09E-3s/s/y)。SFTSV起源于中国中部淮阳山区域,大约42年前病毒开始沿不同方向分化;约37年前,病毒从河南传播到山东;约33年前,病毒从江苏传播到辽宁;约31年前,病毒传播到浙江舟山群岛、日本及韩国南部济州岛。3.人源单克隆抗体制备及其生物学活性研究(1)成功构建表达SFTSV Gn和Gc胞外段蛋白的重组真核表达质粒pCAGGS-SP-Gn-Strep II 和 pCAGGS-SP-Gc-Strep II,通过哺乳动物细胞表达,并纯化Gn和Gc蛋白。细胞上清中,Gn以二聚体、多聚体的形式存在,Gc大部分以单体的形式存在,小部分以二聚体的形式存在。(2)利用Western Blot初步筛选出可以表达抗体的轻、重链质粒组合7组,表达的抗体分别标记为Ab03、Ab05、Ab52、Ab62、Ab63、Ab64和Ab71。除抗体Ab03外其他6株抗体都可以与SFTSV糖蛋白Gn结合;抗体Ab05、Ab63和Ab71能与病毒结合,而抗体Ab03、Ab52、Ab62和Ab64不能与病毒结合;无抗体有中和活性。结论1.自然状态下,鼠类及食虫目动物鼩鼱等小型哺乳动物可感染并携带SFTSV,可能是SFTSV的储存宿主,可能在病毒的传播中起重要作用。与鼠类相比,鼩鼱可能在SFTSV的扩散过程中发挥更重要作用。2.SFTSV进化速率相对较低,基因突变在进化过程中起到纯化作用;基因重配发生率较高,可能是SFTSV进化的主要动力。SFTSV可能源于中国中部淮阳山区域,然后传播至中国东部、东北部地区及日本、韩国。3.在pH为8.0的条件下,SFTSV糖蛋白Gn以聚体的形式存在,而糖蛋白Gc大部分以单体的形式存在,小部分以二聚体的形式存在。4.成功表达出7株人源单克隆抗体,其中6株单克隆抗体有SFTSV糖蛋白Gn的结合活性,3株有SFTSV病毒的结合活性。