研究背景低剂量电离辐射对机体免疫功能的影响是电离辐射健康效应研究的重要方向之一。早期有动物实验研究表明低剂量电离辐射能引起T细胞增殖反应能力增强,T细胞向Thl的方向分化和IL-2分泌细胞数量增加,机体免疫功能有增强的趋势。然而人类流行病学研究资料较少且研究结果不一。2012年UNSCEAR报告基于对原爆幸存者多种细胞因子和T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+T细胞)的研究提出低剂量电离辐射引起机体的炎性反应(inflammatory reaction)或免疫功能扰动(perturbation to immune function),建议进一步研究。机体的免疫功能可通过检测T淋巴细胞的数目和细胞因子的分泌水平等予以评价,单一的指标往往不能准确、全面地衡量机体的免疫功能,2000年出现的抗体微阵列法(Antibody microarray,也称抗体芯片法),能够同时检测几十种甚至几百种细胞因子,可以揭示细胞因子表达谱的改变及各因子之间网络关系。另外,长期低剂量电离辐射对端粒长度的影响也是近年来的研究热点。研究目的本研究旨在通过铀矿工和阳江高本底地区居民外周血淋巴细胞亚群和血清细胞因子表达谱分析,以及外周血基因组DNA端粒长度的变化,探索长期低剂量电离辐射对人体免疫功能和DNA损伤水平的影响,为评价受低剂量辐射照射人群健康效应问题提供直接的人类观察资料,为解决放射防护实践中的问题提供科学依据。研究内容与方法1.从某铀矿选取49名健康男性工人,其中28名井下连续工龄≥5年的铀矿工为暴露组,21名井下连续工龄<5年的铀矿工为对照组,采用定制抗体芯片法检测铀矿工血清中50种细胞因子或其受体的表达谱改变。2从广东阳江高本底地区及对照地区各选取50岁以上健康女性居民100名,采用流式细胞术对外周血淋巴细胞及其亚群(CD4+T、CD8+T淋巴细胞)的数量进行检测。3.从上述高本底及对照地区研究对象中各选择年龄和BMI均匹配的40人,采用定制抗体芯片法对其血清中30种细胞因子或其受体以及重要的血管炎性标志物C-反应蛋白(CRP)进行检测,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进一步对抗体芯片中差异表达细胞因子IL-1α、IFN-γ、MCP-1及sIL-6R、EGFR、CRP进行定量验证。运用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)方法检测上述80名研究对象外周血基因组DNA端粒的相对长度。4.采用独立样本t检验对淋巴细胞亚群数量、细胞因子绝对水平、端粒长度两组间的差异进行分析。利用SAM分析对抗体芯片表达结果进行统计处理,当两组间表达水平差异倍数在1.5倍以上(即Ratio>1.5或Ratio<0.67)并且q-value<0.05时判定为表达差异显著因子。采用多元或多变量线性回归分析方法,估计主要混杂因素调整后各项生物指标与累积剂量间的剂量-效应关系及其效应大小(η2)。结果1.铀矿工的年龄、BMI在暴露组和对照组之间无统计学差异。检测的50种因子中有28种表达。与对照组相比,暴露组铀矿工血清中IP-10、IL-1α、IL-1sRI、IL-3、IL-15为显著表达上调的因子,上调倍数分别为1.78、1.71、1.65、1.62、1.59,q值均小于0.05。另外,IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子表达略有升高,q值均小于0.05,但差异表达倍数均小于1.5。调整年龄和BMI因素后,IL-1α和IL-3的表达水平随着井下累积工龄的增加而显著增加,井下工龄每增加10年,其表达水平分别增加31%、36%,井下工龄造成其表达变化的效应值η2分别为0.16、0.11。2.阳江高本底地区与对照地区居民的平均累积剂量分别为163.83±37.90和43.80±7.28mSv。平均年龄分别为65.64±10.35和60.79+8.10岁,两组间差异有显著性(t=-3.58,p<0.001)；BMI分别为21.84+2.99和22.34±3.25 kg/m2,两组间差异无统计学意义(t=1.08,p=0.28)。流式细胞术检测淋巴细胞及其亚群的结果显示,高本底地区居民的T淋巴细胞总数、CD4+T细胞数、CD8+T细胞数略高于对照地区,但差异无统计学意义。多变量线性回归分析的结果显示,调整年龄、BMI后,T淋巴细胞总数、CD4+T细胞数、CD8+T细胞数均随着累积剂量的增加有增加的趋势；其中,CD8+T细胞数随着累积剂量的增加而显著增加,b=0.001,p=0.037,累积剂量每增加10mSv, CD8+T细胞数量(经Log转换)增加1%。高本底地区血清抗体芯片表达谱研究显示,30种检测指标中有22种表达。与对照地区相比,9种炎性细胞因子或其受体IFN-γ、IL-1α、MCP-1、IL-8、GRO、IL-10、 VEGF、EGFR、sIL-6R以及CRP表达显著上调,Ratio>1.5倍且q<0.05。调整年龄、BMI后,这些显著上调因子的总体表达水平均随累积剂量的增加显著增加,p<0.001。采用ELISA方法定量验证了高本底地区居民血清中IL-1α、IFN-γ、MCP-1及SIL-6R、 EGFR、CRP的绝对表达水平。其中,IL-1α的绝对浓度在检测下限以外未能测得,其余5个指标的表达结果均显示与芯片表达结果一致,高本底地区居民血清中的水平均显著高于对照地区,并且累积剂量对这5个因子的表达整体上有显著影响,p<0.001。CRP、MCP-1及sIL-6R的表达与累积剂量之间呈良好的线性剂量响应关系,累积剂量每增加10mSv,其表达水平(Log(CRP)、Log(MCP-1)、sIL-6R)分别增加8.68%、1.89%、84.51%。累积剂量对其表达的作用强度(η2)依次为0.21、0.15、0.26。而IFN-γ和EGFR水平与累积剂量之间的线性关系不明显。3.外周血基因组DNA端粒长度的检测结果显示,高本底地区居民外周血端粒相对长度(2.0±0.20)显著低于对照地区(2.75±0.22),t=2.146,p=0.035。但是,调整年龄、BMI后,高本底地区居民外周血端粒长度随着累积剂量(50～、100～、200+mSv)的增加显著增加,调整后的端粒平均长度(经Log转换)分别为0.520、0.558、0.569,剂量每增加10mSv,端粒长度增加7.33%。结论人体接受低剂量慢性照射可能影响机体免疫功能,表现为外周血CD8+T淋巴细胞数量增加、炎性标志物(如sIL-6R、CRP、MCP-1、IFN-γ等)的表达上调。另外,长期低剂量辐射可能造成外周血基因组DNA端粒长度的改变。