双氯芬酸具有抗炎、镇痛及解热作用,是临床应用非常广泛的非甾类消炎止痛药。但双氯芬酸具有不可忽视的不良反应,尤其是肝毒性的风险,包括肝细胞炎症、坏死、甚至导致极个别患者死亡等毒性反应。目前的研究仍未彻底阐明双氯芬酸引起肝毒性的机制。目前大部分的研究都表明,双氯芬酸的毒性是由其代谢产物所引起。在人体内,双氯芬酸主要是通过药物代谢酶CYP2C9和CYP3A4进行催化代谢的。CYP2C9催化生成4’-羟基双氯芬酸的比例占大部分,而CYP3A4代谢成5羟基-双氯芬酸则占较少比例。5羟基-双氯芬酸的生物化学活性非常高,可与肝细胞内蛋白质形成加合物,导致直接的细胞功能障碍或者引发机体免疫反应,间接引起肝脏细胞的损伤。在实验动物尤其是小鼠体内,由于代谢酶的种属差异性,双氯芬酸在野生型动物体内的毒性机制不能完全反应人体内的机制。因此,本研究采用人拟化的Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠作为动物模型进一步阐述其肝毒性机制,该小鼠转入了人的PXR基因和CYP3A4基因,与人CYP3A4的代谢途径接近,能高度模拟人CYP3A4转录、表达和代谢功能,是一个非常有价值的人拟化转基因动物模型。本实验采用此工具鼠初步研究了双氯芬酸的肝毒性机制,内容如下:1.Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠的引种、繁育及子代鉴定研究本实验首先对新引入的Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠进行单线近交繁育、基因鉴定和种群扩大。采用阳性基因扩增法鉴定了Tg CYP3A4/h PXR小鼠的转基因阳性率。结果表明:近亲繁殖三代后,CYP3A4/h PXR基因的阳性整合在95%以上,Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠基本培育成功,基因丢失、漂移等现象出现概率较低,转入基因能稳定遗传,表明本实验室通过此繁殖方法已经建立了稳定遗传的Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠品系。2.Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠药代动力学特性研究在新药候选物的开发过程中,差劣的药代动力学(包括药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒性,ADME-Tox)性质是药物筛选的主要瓶颈,其中由于药物相互作用导致的药物毒性又是关乎安全性的关键问题,而由PXR调控的药物代谢酶CYP450的抑制和诱导是代谢毒性中的核心。本部分实验拟对双氯芬酸在Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠的药代动力学性质进行系统的研究,在Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠体外考察了剂量与血药浓度的线性关系,对Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠腹腔注射双氯芬酸后的血药浓度进行了测定,研究其血药浓度的线性关系,确证血药浓度与毒性表型的相关性;并对Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠品系及人的肝微粒体混合酶参数进行对比研究,采用底物消除法测定双氯芬酸在人肝微粒和Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠肝微粒中的表观酶动力学参数Km和Vmax。同时,本实验还考察了Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠药物代谢酶3A4对阳性化合物咪达唑仑和酮康唑抑制能力的检测,计算其相应的IC50(半数抑制浓度)值。本部分实验将有利于了解双氯芬酸在该小鼠中的代谢稳定性与人体内的区别所在。并且积累Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠代谢的基础资料,有助于推动其在临床前药物评价中的应用。3.双氯芬酸致Tg3A4/h PXR双转基因小鼠肝毒性表型的建立当小鼠种群扩大至实验要求的数量时,选取CYP3A4/h PXR基因阳性、6周龄、雌性小鼠进行实验,以野生型Balbc小鼠作为对照,生理盐水作为阴性对照,各实验组腹腔注射双氯芬酸,剂量为80mg/kg、80mg/kg加利福平诱导组、160mg/kg、160mg/kg加利福平诱导组,全部为单次给药。腹腔注射双氯芬酸24小时后,采取各实验组小鼠的全血,然后离心,取上清,测定血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量。采血结束后,行安乐死,大体解剖观察各器官有无异常。取小块肝脏组织,浸泡在福尔马林溶液,待做病理切片。结果表明:在Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠实验组中,ALT和AST均显著高于给药前,在使用利福平诱导后的实验组中尤为显著。而作为对比,在野生型Balbc小鼠实验组中,双氯芬酸给药前后,血清ALT和AST并无显著变化。肝脏病理切片同样证实该现象。因此,我们认为采用Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠建立了稳定的双氯芬酸肝毒性模型,可正确模拟人体内由双氯芬酸引起的肝毒性。4.双氯芬酸致Tg3A4/h PXR双转基因小鼠肝毒性代谢组学研究采用代谢组学技术研究Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠腹腔注射双氯芬酸后,其内外源、化合物的变化。采用的方法包括:最小二乘判别分析法(PLS-DA)、主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA),对双氯芬酸腹腔注射Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠前后的代谢物谱差异进行分析。作scores plot图和载荷图(Loading plot),到差异性质荷比。然后与数据库(www.hmdb.ca,Chemspider)进行搜索比对,通过显著性差异检验以及重要变量因子可找出有差异的代谢物,寻找有差异性的化合物,可初步发现双氯芬酸致Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠肝毒性相关的生物标志物。实验结果表明:Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠腹腔注射双氯芬酸后,其积分矩阵图与给药前完全分离,可显著区分;在载荷矩阵图中,大部分数据信息集中在一起,只有少量数据点发生了显著变化,偏离聚集聚区域。数据库数据分析表明:Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠腹腔注射双氯芬酸后,共发现10个有差异性的内源或外源化合物,大部分化合物较给药前的含量更高,小部分化合物低于给药前的含量。10个差异化合物为:缬氨酸(下降)、6,8-二羟基嘌呤(升高)、苯丙酮酸(升高)、苯乳(升高)、十六酰胺乙醇(下降)、5-羟基-6-甲氧基吲哚葡糖苷酸(下降)、核黄素(升高)、溶血性磷脂酰胆碱系列(升高)、氧化性谷胱甘肽(升高)、左甲状腺素酚葡萄糖苷酸(升高)。其生物活性表现在谷胱甘肽(GSH)消耗、三羧酸循环和能量代谢异常以及炎症介导的毒性通路相关等。5.炎症因子介导5羟基-双氯芬酸致小鼠肝毒性的机制初探本部分实验包括对肝细胞的直接毒性作用以及免疫因子增值两个层面进一步明确双氯芬酸的肝毒性机制。首先分离Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠的原代肝细胞,采用MTT法检测双氯芬酸、4’羟基-双氯芬酸和5羟基-双氯芬酸对小鼠原代肝细胞是否有抑制作用。然后在Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠中腹腔注射双氯芬酸、4’羟基-双氯芬酸和5羟基-双氯芬酸。分离外周血测定相关炎症因子IL-1β,IL-6,IL-10和IL-17。结果表明:双氯芬酸及其代谢产物在原代体外培养的肝细胞中并不呈现任何抑制作用,因此,推测存在体外因子参与等多重机制协同作用导致肝毒性。在分离的Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠外周血炎症因子的表达实验中,5羟基-双氯芬酸能诱导炎症因子IL-6和IL-17的表达水平显著升高。提示机体炎症因子与毒性通路有一定的相关性。总之,本研究利用Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠为研究对象,从美国NIH引进Tg CYP3A4/h PXR双转基因小鼠,并成功进行了繁育和鉴定。同时对双氯芬酸体内体外的药代动力学特性、肝微粒体的抑制诱导情况进行了系统研究,建立了肝毒性表型、内外源物质的代谢物轮廓分析以及代谢物致炎症因子增殖等毒性机制进行了初步探索,为进一步研究双氯芬酸引起肝毒性机制提供基础数据和研究方向。