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目的:高尿酸血症(HUA)与多种疾病相关,如痛风,糖尿病。相关研究表明2型糖尿病(T2DM)患者的HUA发生率分别为24.1%和33.8%。并且,HUA已被证明是肾脏疾病进展的独立危险因素,它可引起肾脏炎症,诱发氧化应激并引起肾小管损伤。因此,急需开发一种新型药剂来同时改善高血糖和高尿酸血症。恩格列净(Empagliflozin),一种新型的钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂,通过阻断肾近曲小管表面SGLT2受体,抑制葡萄糖的重吸收,促进尿液中葡萄糖的排泄,从而发挥降糖的作用。诸多文献报道,Empagliflozin除降糖作用外,还有降低血尿酸(SUA),降低心血管死亡率及降低血压等作用。而Empagliflozin降低血尿酸的具体分子机制尚不清楚。在本研究中,我们提出了一种可能的机制来解释Empagliflozin如何减轻高尿酸血症,并为高尿酸血症的治疗提供有见地的指导。方法:1、动物水平:选取6周龄的雄性KK-Ay小鼠(一种自发型T2DM模型小鼠)作为研究对象,给予KK-Ay小鼠专用饲料,适应性喂养2周后将它们随机分为3组:糖尿病空白对照组(KK-Ay组,n=10),糖尿病伴高尿酸血症模型组(KK-Ay+HUA组,n=10),Empagliflozin治疗组(KK-Ay+HUA+EMP组,n=10)。氧嗪酸钾(PO)和次黄嘌呤(HX)腹腔注射诱导高尿酸血症,Empagliflozin灌胃治疗。8周后经代谢笼留取小鼠24h尿标本,经摘眼球取血法留取空腹血标本,肾脏、回肠组织取材。HE,PAS法观察肾脏和回肠组织形态变化。RT-PCR、WB法检测UA转运体ABCG2、OAT1、OAT3、GLUT9和URAT1在肾脏和回肠中的相对表达。WB法进一步验证p-AMPK、p-Akt和p-CREB通路蛋白在两种组织中的相对表达。2、细胞水平:用含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基培养人肾小管上皮细胞(HK-2)。将细胞分为四组:(1)高糖对照组,即HG组(30mmol/L);(2)高糖伴高尿酸(10mg/dl)模型组,即HG+HUA组;(3)高糖伴高尿酸模型下恩格列净(50umol/L)治疗组,即HG+HUA+EMP组;(4)AMPK抑制剂(Dorsomorphin)组(10umol/L),即HG+HUA+EMP+Dorsomorphin组。WB法检测尿酸转运体ABCG2和p-AMPK、p-Akt和p-CREB通路蛋白表达。PCR或WB法检测ABCG2启动子质粒和CREB过表达质粒转染效率。Lipo2000瞬时共转染以下七组质粒:(1)ABCG2启动子质粒和CREB过表达质粒(ABCG2+CREB);(2)ABCG2启动子质粒和CREB空载质粒(ABCG2+CREBNC);(3)ABCG2空载质粒和CREB质粒(ABCG2NC+CREB);(4)ABCG2空载质粒和CREB空载质粒(ABCG2NC+CREBNC);(5)ABCG2启动子511到518位点单突变质粒和CREB质粒(ABCG2mut511+CREB);(6)ABCG2启动子833到840位点单突变质粒和CREB质粒(ABCG2mut833+CREB);(7)ABCG2启动子511到518位点和833到840位点双突变位点质粒和CREB质粒(ABCG2 double mut511/833+CREB)。采取Ch IP实验和荧光素酶报告基因检测实验检测CREB与ABCG2启动子质粒结合情况。结果:1、与糖尿病空白组(KK-Ay)和糖尿病伴高尿酸血症组(KK-Ay+HUA)相比Empagliflozin治疗组(KK-Ay+HUA+EMP)可显着降低血糖、血尿酸水平,但是却增加尿糖、尿尿酸排泄和尿酸排泄率(FEUA)(P<0.05)。肾脏HE和PAS染色显示,与KK-Ay组小鼠相比,KK-Ay+HUA组小鼠显示出较明显的肾小管扩张,水肿变性和肾小球系膜沉积,而这些特征在KK-Ay+HUA+EMP组中显着减弱;回肠的HE和PAS染色显示,KK-Ay+HUA组呈现出不规则绒毛、倒伏和炎性细胞浸润显着增加的现象,而这种现象在KK-Ay+HUA+EMP组中部分改善。2、q RT-PCR结果显示,在Empagliflozin治疗下,肾脏中跟尿酸排泄功能相关的受体ABCG2、OAT1、OAT3表达上调(P<0.05),而跟尿酸重吸收功能相关的受体URAT1表达下降(P<0.05)。同样地,在回肠组织中也呈现出跟尿酸排泄相关受体ABCG2表达上调(P<0.05),而跟尿酸重吸收相关受体GLUT9无明显变化。WB显示恩格列净可以使尿酸排泄相关受体ABCG2表达上调(P<0.05),而其它受体均无明显变化。3、WB结果表明在肾脏和回肠组织中KK-Ay+HUA+EMP治疗组均呈现出p-AMPK/p-Akt/p-CREB信号通路蛋白表达增加(P<0.05),而KK-Ay与KK-Ay+HUA组间无明显差异。4、人肾小管上皮细胞(HK-2)中也观察到相同的表现(P<0.05),给予AMPK抑制剂(Dorsomorphin)后,ABCG2受体和p-AMPK/p-Akt/p-CREB信号通路蛋白均呈现明显下调(P<0.05)。免疫荧光结果与WB结果一致。5、在HK-2细胞中使用Ch IP实验验证CREB可以与ABCG2启动子结合;在HEK-293A细胞中转染质粒过表达ABCG2,再次用Ch IP实验验证,与转染空载质粒组相比,ABCG2过表达组呈现出CREB与ABCG2启动子区更多的结合(P<0.05)。6、使用荧光素酶报告基因检测实验进一步验证CREB可以与ABCG2启动子区结合(P<0.05)。根据JASPAR数据库预测的CREB与ABCG2启动子区的可能结合位点,设计并合成了ABCG2启动子511-518、833-840区段位点的单突变和双突变质粒,分别和CREB质粒共转染与HEK-293A细胞中,再次使用荧光素酶报告基因检测实验发现CREB与ABCG2突变序列结合程度降低(P<0.05)。结论:1、恩格列净降低血尿酸水平,增加尿尿酸排泄。2、恩格列净改善肾脏和回肠的组织病理学变化。3、恩格列净促进肾脏和回肠中ABCG2的表达。4、恩格列净在肾脏和回肠中通过调控AMPK/Akt/CREB信号通路改善血尿酸水平。5、恩格列净在人肾小管上皮细胞(HK-2)中通过调控AMPK/Akt/CREB信号通路改善血尿酸水平。6、染色质免疫沉淀(Ch IP)测定以证明CREB与ABCG2启动子结合。7、荧光素酶报告基因检测实验证明CREB与ABCG2启动子结合。8、恩格列净通过AMPK/Akt/CREB信号通路上调ABCG2的表达,进而降低2型糖尿病合并高尿酸血症小鼠的血尿酸水平。