镁离子通过Notch通路促进骨髓间充质干细胞成血管分化的实验研究

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目的:筛选出促进SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成血管分化的最适镁离子浓度;探究镁离子是否通过Notch信号通路促进BMSCs成血管分化。方法:使用贴壁法分离大鼠BMSCs;流式细胞对BMSCs进行表面标记物鉴定;根据外加干预镁离子浓度不同将实验分为6组(对照组、2、5、10、20、40 mmol/L);CCK-8法检测各组BMSCs的增殖能力;Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染分析各组BMSCs的毒性;各组加入成血管诱导培养基诱导7天后,RT-qPCR检测成血管相关mRNA表达量,基质胶成管实验检测血管形成情况。得到最适镁离子浓度后,将实验分为5组:BMSCs加普通培养基对照组(A组)、BMSCs加入血管内皮诱导培养基组(B组)、BMSCs加入5mmol/L镁离子的血管内皮诱导培养基组(C组)、BMSCs加入2 μmol/L DAPT和血管内皮诱导培养基组(D组)、BMSCs加入2μmol/L DAPT和5 mmol/L镁离子的血管内皮诱导培养基组(E组)。每组分别培养7天、14天后,用RT-qPCR和Western Blot检测各组细胞相关mRNA和蛋白的表达量,划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移能力,基质胶成管实验检测各组血管形成情况。结果:(1)分离出的BMSCs表面抗原CD29、CD90呈高表达,CD45、CD34低表达。(2)CCK-8显示第1、3、5、7天,2、5、10 mmol/L镁离子组BMSCs增殖比对照组强,其中5 mmol/L镁离子组最强;20、40 mmol/L镁离子组BMSCs的增殖比对照组减弱。(3)2、5、10 mmol/L镁离子组的死细胞数较对照组无明显差异。20、40 mo1/L镁离子组死细胞数较对照组明显增多。(4)2、5 mmol/L镁离子组成血管相关mRNA的表达、血管数量较对照组增多;其中5 mmol/L镁离子组较其他组增加更明显。(5)B、C、D、E组成血管相关mRNA和蛋白的表达以及成血管数量较A组更多且细胞的迁移能力更强,且14天较7天更好(p<0.05)。(6)B、C组较D、E组的成血管分化相关mRNA和蛋白表达以及成血管数量更多,细胞的迁移能力更强,且14天较7天更好(p<0.05)。(7)C组较B组的成血管分化相关mRNA和蛋白表达以及成血管数量、细胞的迁移能力更强且14天较7天更好(p<0.05)(8)D组与E组成血管分化相关mRNA和蛋白表达以及成血管数量、细胞的迁移能力均无统计学差异。结论:(1)2、5、10 mmol/L镁离子对BMSCs的增殖起到促进作用,且5 mmol/L镁离子可能对BMSCs的增殖和成血管分化促进作用最强。(2)镁离子通过Notch信号通路增强BMSCs的成血管分化并增强诱导后细胞的迁移能力。
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