目的：在动脉粥样硬化斑块形成和血管成型术后再狭窄等血管重塑性疾病的发生发展过程中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）表型发生转化，即从分化型转变为去分化型并获得再增殖的能力。SM22α表达是VSMC处于分化表型的重要标志，是鉴定VSMC表型状态的常用指标。但由于目前缺乏市售的SM22α抗体，故只能在转录水平上检测SM22α基因表达活性，而不能应用Western blot和免疫组化等方法直接检测SM22α蛋白，在一定程度上限制了SM22α在VSMC表型鉴定方面的应用。基于SM22α是VSMC的胞内蛋白质，含量低，提取纯化困难这一事实，本研究利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达人SM22α （hSM22α）蛋白，经分离纯化后用其免疫新西兰白兔，制备兔抗hSM22α多克隆抗体后，用以检测VSMC表型转化过程中SM22α的表达变化，为研究SM22α表达与VSMC分化和去分化以及形态与功能的关系奠定基础。方法1 hSM22α酵母表达载体的构建：以含有hSM22α全长cDNA序列的重组子pGEM3z-hSM22α为模板，经PCR 扩增hSM22αcDNA。扩增产物经内切酶图谱和测序鉴定无误后，定向克隆至酵母表达质粒pPIC9，构成pPIC9-hSM22α。2酵母转化及表型筛选：将被Sac I酶切线性化的<WP=4>pPIC9-hSM22α质粒转化至用氯化锂法制备的酵母感受态细胞GS115。利用组氨酸缺陷的MD和MM平板及PCR筛选阳性重组子。3 hSM22α的诱导表达：用甲醇诱导GS115-pPIC9-hSM22α表达hSM22α，于诱导的不同时间收集培养基行SDS-PAGE电泳，确定甲醇诱导SM22α表达的最佳时间。4 hSM22α的纯化：甲醇诱导hSM22α表达84 h后，收集培养液用35%～70%饱和度的硫酸铵分级沉淀。沉淀经透析后用CM-Cellulose柱层析纯化hSM22α，SDS-PAGE进行纯度鉴定。5 hSM22α抗体制备和效价测定：以hSM22α常规免疫新西兰白兔，制备兔抗hSM22α多克隆抗体。用双向琼脂糖免疫扩散实验检测抗体效价。6血管新生内膜形成过程中SM22α表达的变化：用Western blot方法检测大鼠球囊导管内皮剥脱术后不同时间主动脉血管平滑肌细胞 SM22α表达变化。结果1 hSM22α酵母表达载体的构建：测序结果显示，经PCR扩增合成的hSM22αcDNA与hSM22αORF序列完全一致。所构建的重组质粒pPIC9-hSM22α经内切酶图谱及PCR鉴定，均得到预期大小的片段。2酵母转化及表型筛选：经MD和MM平板筛选后得到2株基因型为His+Mut+的转化子。提取转化子的基因组DNA进行PCR鉴定，只有1株PCR的扩增产物长度为600 bp左右，与预期片段位置一致。 <WP=5>3表达产物的鉴定：SDS-PAGE结果显示，在甲醇诱导24 h后，在预期的22 kD左右的位置上出现蛋白条带，随着诱导时间的延长，蛋白条带逐渐加深，至84 h时，蛋白表达量达到峰值。未转染pPIC9-hSM22α的GS115被甲醇诱导84 h后，该位置没有蛋白条带出现。4 hSM22α的纯化：表达产物经硫酸铵分级沉淀和离子交换层析纯化后，在SDS-PAGE上显示一条蛋白条带，分子量为22 kD。5 hSM22α抗体的制备和效价测定：双向琼脂糖免疫扩散实验结果显示，在中心抗原孔与周围抗体孔之间有一条围绕中心孔出现的半环形相互融合的白色沉淀线，无交叉现象，无非特异性沉淀线出现。表明所制备的兔抗hSM22α抗体具有较高的特异性，效价为1：4（双扩）。6 hSM22α抗体的应用：Western blot结果表明，血管提取液在20 kD左右的位置上出现两条蛋白条带，与SM22α在血管组织中存在两种形式的文献报道一致。表明所制备的SM22α抗体可以特异识别不同形式的SM22α。灰度扫描显示，在血管内皮剥脱所导致的新生内膜形成过程中， SM22α表达逐渐下降，14天降至最低，21天后趋于恢复。结论1成功构建了hSM22α巴斯德毕赤酵母表达系统，外源性hSM22α在酵母中得到有效表达和分泌。2经硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得电泳纯的重组hSM22α。3制备了兔抗hSM22α多克隆抗体，且该抗体可以特异性识别不同形式的SM22α。 <WP=6>4用所制备的抗体检测大鼠血管新生内膜形成过程中SM22α表达变化，发现血管内皮剥脱后SM22α表达逐渐下降，14天降至最低，21天后开始恢复。