束(Ziziphus jujube Mill.)系鼠李科(Rhamanceae)枣属(Ziziphus Mil1.)植物,原产中国,是我国重要的木本粮食树种之一,有3000多年的栽培历史。枣果实营养丰富,食用和药用价值都很高。与一般经济林果相比,枣具有独特的开花结果特性。枣花芽在结果枝上萌发,伴随着结果枝的生长完成分化并开花结实。尤其是,枣童期短,实生苗栽植当年即可开花结果。因此弄清楚枣的这种独特的开花机理将为通过基因工程手段进行缩短童期、果树育种提供重要的科学指导,为此,本文通过花发育解剖学研究、抑制消减SSH文库的构建、花发育相关基因的克隆表达与功能研究等,系统研究了枣花发育过程及表达的关键基因,以期为揭示枣花发育机理奠定基础。主要研究结果如下：1.枣花发育解剖学研究。以枣品种‘金丝4号’为研究对象,研究了枣花发育过程。‘金丝4号’枣花芽分化从形态上可分为六个时期,即未分化期,分化期,萼片分化期,花瓣分化期,雄蕊分化期和雌蕊分化期。‘金丝4号’枣花药为4室,花药壁4-5层,分别为表皮、1-2层药室内壁、中层和腺质绒毡层,花药壁的发育属于基本型；小孢子母细胞胞质分裂为同时型,四分体排列多为正四面体；‘金丝4号’枣花粉为三角形,具三个萌发孔,三沟,成熟花粉为2-细胞型；大孢子母细胞经减数分裂中期、后期、末期形成的四分体大孢子呈线型排列,唯合点端的功能大孢子经过3次有丝分裂后,形成七细胞八核胚囊；倒生胚珠,双珠被,厚珠心,胚囊结构为蓼型。在‘金丝4号’枣花发育过程中,其内部解剖结构与花外部形态特征之间有着相对稳定的关系。2.抑制消减杂交文库的构建。以‘金丝4号’枣不同发育时期花蕾和叶片为材料,进行总RNA提取、mRNA分离纯化、cDNA合成、酶切、连接,以枣花蕾和叶片cDNA互为Tester和Driver,通过抑制消减杂交及效率检测后,将抑制消减杂交产物与pGEM-T载体连接形成重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5Q,构建了相应的抑制消减杂交SSH文库。枣花SSH文库共得到约3578个菌落,其中白斑3294个,重组率为92.05%；枣叶SSH文库共得到约4055个菌落,其中白斑3660个,重组率为90.26%。随机挑取克隆,使用引物T7/SP6进行菌液PCR检测,两个文库均有95%以上的克隆含有目的插入片段,插入片段大小各异,基本介于200bp-2000bp之间,多数集中在1000bp左右,表明两个SSH文库的插入片段大小符合要求。3.枣花器官EST序列生物信息学分析。从枣花SSH文库中随机挑取1000个阳性克隆进行测序,获得912条原始序列,883条大于100bp的高质量EST序列,其中598条分布于1101bp-1300bp之间,组装拼接获得96个单值基因,其中Contigs43个,Singletons53个。96条单值基因中预测得到73个ORF。在核苷酸数据库中,有72条单值基因找到同源序列,其中登录号为EF440352.1和U42399.1序列为花发育相关的桃MADS7基因和辐射松MADS1基因。在Nr库中,70条单值基因找到了同源序列,其中,登录号为BAF95941.1(?)口AAD09206.1的序列分别为花发育相关的温州蜜柑SEPALLATA1基因和辐射松MADS-box基因。在SWISSPROT库中,43条单值基因找到了同源序列。将单值基因序列与COG库进行Blast分析,获得有注释的序列20条,功能分类为7类,即翻译、核糖体结构与生物合成,翻译修饰、蛋白折叠与伴护蛋白,糖类转运与新陈代谢,脂质转运与新陈代谢,复制、重组与修复,细胞骨架蛋白,蛋白结合,数目分别为5,4,4,3,2,1,1。4.枣叶EST序列生物信息学分析。随机挑取1000个阳性克隆进行测序,获得806条原始序列,735条大于100bp的高质量EST序列,其中438条分布于11101bp-1200bp之间,组装拼接获得86个单值基因,其中Contigs为45个,Singletons为41个。86条单值基因中预测得到70个ORF。在核苷酸数据库中,有71条单值基因找到同源序列；在Nr库中,有66条单值基因找到同源序列；在SWISSPROT库中,有41条单值基因找到同源序列。将单值基因序列与COG库进行Blast分析,获得有注释的序列23条,功能分类为6类,即糖类转运与新陈代谢,氨基酸转运与新陈代谢,辅酶转运与新陈代谢,能量产生与转换,复制、重组与修复,细胞组分,数目分别为12,3,2,2,2,2。5.枣ZjMADS1-box基因的cDNA克隆、序列分析与表达特征。根据已知枣ZjMADS1-box基因476bp的EST序列信息,设计特异引物,分别通过5’RACE和3’RACE技术获得了ZjMADS1-box基因的5’和3’末端序列,通过拼接,获得全长cDNA序列。枣ZjMADS1-box的cDNA全长957bp,5’非转录区70bp,3’非转录区224bp,全部编码序列为663bp,编码220个氨基酸。枣ZjMADS1-box基因具有MADS-box B类PI基因的典型特征,含MADS结构域、K结构域以及PI结构域。无论在DNA序列还是氨基酸序列水平上,枣ZjMADS1-box都与辣椒CaPI的相似性最低,分别为69.7%,61.8%,与白千层MqPI的相似性最高,分别为81.3%,72.6%。束ZjMADS1-box蛋白预测分子量为25587.5Da,等电点为9.75,是一种弱碱性较不稳定蛋白。枣ZjMADS1-box蛋白疏水指数位于-3.033到2.100之间,整个蛋白质基本上表现出亲水性。枣ZjMADS1-box蛋白不含信号肽,属于非分泌性蛋白,含28个α螺旋,27个β折叠链和31个卷曲。枣ZjMADS1-box基因在结果枝、营养枝、嫩茎、成熟叶和腋芽中均没有表达,在5个时期的花蕾中都有表达,但表达量变化不大,仅在4.30日和5.8日所取花蕾中的表达量稍低于其他3个时期的样品中的表达量。6.枣ZjSEP1基因的cDNA克隆、序列分析与表达特征。根据已知枣ZjSEP1基因338bp的EST序列信息,设计特异引物,分别通过5’RACE和3’RACE技术获得了ZjSEP1基因的5’和3’末端序列,通过拼接,获得ZjSEP1基因的全长cDNA序列。束ZjSEP1的cDNA全长1149bp,5’非转录区106bp,3’非转录区308bp,全部编码序列735bp,编码244个氨基酸。枣ZjSEP1基因具有MADS-box E类SEP基因的典型特征,含MADS结构域、K结构域和SEP结构域。在DNA序列水平上,枣ZjSEP1基因与番茄LeMADS1相似性最低,为66.8%,与桃PpMADS7的相似性最高,为84.2%；在氨基酸水平上,枣ZjSEP1基因与辣椒CaMADS1的相似性最低,为61%,仍与桃PpMADS7的相似性最高,为86.1%。枣FsSEP1蛋白预测分子量为28073.9Da,等电点为9.13,是一种弱碱性蛋白,属于较不稳定蛋白质。枣ZjSEP1蛋白的疏水指数从-2.322到2.122,整个蛋白质基本上表现出亲水性。枣ZjSEP1蛋白不含信号肽,属于非分泌性蛋白,含27个a螺旋,26个β折叠链和32个卷曲。枣ZjSEP1基因在营养器官的结果枝和腋芽中有微量表达,在花蕾的5个时期中均有表达,表达量变化不大,仅在5.4日所取花蕾中的表达量稍低于其他4个时期的样品中的表达量。7.枣ZjLFY基因的cDNA克隆与生物信息学分析。通过兼并RT-PCR从枣花蕾中扩增出一445bp的cDNA序列,Blastn分析确定其为LFY同源基因,在此序列基础上,通过RACE技术获得了ZjLFY基因的全长cDNA克隆。将ZjLFY基因cDNA序列提交至GenBank,接受号为JN165097。枣ZjLFY基因cDNA全长1517bp,5’非转录区50bp,3’非转录区258bp,全部CDS1209bp,编码402个氨基酸。ZjLFY含2个可变区和2个保守区。在DNA序列水平上,ZjLFY基因与意大利兰OiLFY和舌兰SlLFY的相似性最低,皆为60.7%,与板栗CmLFY的相似性最高,为77.2%；在氨基酸水平上,ZjLFY基因与意大利兰OiLFY基因的相似性最低,为57%,与胡桃JrLFY的相似性最高,为83%。ZjLFY蛋白预测分子量为45221.7Da,等电点为6.29,属于较稳定蛋白。ZjLFY蛋白疏水指数从-3.667到1.756,整个蛋白基本上表现出亲水性。ZjLFY蛋白不含信号肽,含36个α螺旋,40个p折叠链和47个卷曲。8.枣ZjLFY基因的表达模式研究。通过RT-PCR扩增获得枣肌动蛋白基因Zjactin,以Zjactin为内参基因,对枣不同发育阶段的花蕾以及结果枝、营养枝、嫩茎、成熟叶和腋芽等营养器官进行ZjLFY基因的半定量RT-PCR分析。结果表明,束ZjLFY基因在生殖器官花蕾和营养器官中均有表达。总体上在整个花蕾发育期间的表达强烈,表达量要明显高于结果枝、营养枝、嫩茎、成熟叶和腋芽等营养器官。在花蕾中,ZjLFY基因在4月30日至5月8日间的表达量均非常强烈,表达量无明显差别,从5月10日开始,表达量逐渐呈下降趋势。ZjLFY基因在结果枝、营养枝、嫩茎、成熟叶和腋芽中表达量均较低,但相对而言,在结果枝和嫩茎中的表达量稍高于营养枝、成熟叶和腋芽。ZjLFY基因的表达模式表明该基因无论在枣的生殖生长还是营养生长阶段均行使了其功能,但与生殖生长间的关系更密切。9.枣ZjLFY基因转拟南芥的功能研究。对ZjLFY的cDNA片段和pBI121载体分别进行Xba Ⅰ和BamH Ⅰ的双酶切,回收连接,构建植物表达载体pBI-ZjLFY,将pBI-ZjLFY质粒转化农杆菌LBA4404,然后采用花粉管通道法对10株拟南芥进行农杆菌转基因实验,转化后收获T0代种子,经含抗性培养基筛选,得到阳性植株。通过PCR验证,筛选出T1代含ZjLFY的转基因拟南芥,继续通过自交并收取种子,结合抗性筛选,最终获得了T2代拟南芥纯合系,对T2代转基因拟南芥与野生型对照培养观察,发现转基因拟南芥提前11天便可开花,表明转入外源的枣ZjLFY基因后,使拟南芥提前进入生殖生长阶段,从而有效缩短了拟南芥的开花结实时间。