研究背景和目的目前,肺癌(lung cacner)是全世界癌症相关死亡的主要原因；最新研究显示在中国肺癌是最常见的肿瘤。肺癌主要分为两大类型,小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。临床上常见的类型为NSCLC,大约占肺癌总数的80-85%。肺癌的生存有赖于早期诊断和早期治疗,但是由于肺癌早期缺乏典型的临床症状,因此大约70%的患者就诊时已处于晚期,极大的缩短了肺癌患者的生存时间。最新数据显示在中国,经过年龄矫正后5年生存率仅有15.4%。因此,进一步研究肺癌发生的分子机制以期对其早期筛查及临床管理有所助益是很必要的。有丝分裂(mitosis)是真核细胞分裂产生体细胞的过程,是维持个体正常生长、发育和保证物种连续性、稳定性的重要体现。有丝分裂的有序进行依赖很多基因网络的调控。其中,周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)是有丝分裂中的重要参与者,它包括了CDK1(又称cdc2)、CDK2、CDK3等。Cdc2蛋白的表达可以促进有丝分裂过程中G2期向M期的转化,过度表达可使细胞周期进程紊乱,进而导致细胞的异常增殖。周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, P21),可以减少cdc2的表达,对细胞周期起着负调控的作用。有丝分裂的紊乱在肿瘤发生发展中扮演着非常重要的作用。而多个研究证实驱动蛋白超家族蛋白(kinesin superfamily proteins, KIFs)中的多个成员是有丝分裂过程中昕必须的；因此,这些蛋白表达的改变可能会导致癌症的发生。KIFs可以与微管结合,并通过沿着微管运动参与一些细胞器、蛋白复合物和信使RNA (messenger RNAs, mRNAs)的运输；他们同样涉及有丝分裂和减数分裂中染色体核纺锤丝的移动。KIFs超家族包含45个成员,驱动蛋白家族成员14(Kinesin family member 14, KIF14)与其他的成员有所不同,因为其负极末端的定向能动性。KIF14可以通过与胞质分裂调控蛋白1(Protein Regulator of cytokinesis 1, PRC1)相互结合作用于中心纺锤体,从而调节胞质分裂的过程。相关研究证实在视网膜母细胞瘤以及原发性肺癌组织中KIF14是过表达的,并且KIF14的表达可以作为肺癌生存的独立预后因子。体外实验也表明KIF14的敲除减少了肿瘤的发生。C末端驱动蛋白1(Kinesin family member C1, KIFC1)是哺乳动物细胞内KIF14家族中的唯一成员,它有4个转录本,包含20个外显子。KIFC1参与精子核膜形成以及顶体的延伸过程,同样也是有丝分裂中染色体中板集合和有序排列过程所必需的。类似于KIFs对细胞内物质的转运,KIFC1同样可以参与双链DNA等的运输。也有研究显示,KIFC1与多种疾病的发生发展有关。例如,与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)目关基因结合,并参与纤毛不动综合征(immotile cilia syndrome, ICS)的发生；在卵巢癌原发病灶以及转移病灶中KIFC1的表达较周围正常组织较高；无论早期还是晚期的肺癌中KIFC1的高表达预示着脑转移的出现。多个实验表明KIFC1参与癌症发生发展的过程。公共数据库上也显示KIFC1在肺癌组织中高表达,并且与差的预后相关。然而,KIFC1的表达在NSCLC的发生发展中的作用机制还不是特别清楚。基于网络数据库及相关文献的报道,我们采用不同的实验技术在多中心的临床标本中进行KIFC1表达的检测,并在探讨KIFC1在肺癌细胞系生长中所扮演的角色以及其具体的作用机制。研究方法1.原发性肺癌组织中KIFC1表达的检测以及与生存预后的关系首先,利用公共数据库公开和便捷的特点,在数据库中查找KIFC1在肺癌组织中的表达情况以及表达高低与生存预后之间的关系；其次,我们收集2014年至2015年间,就诊于南京军区南京总医院胸外科并行手术切除治疗的肺癌患者的癌组织以及配对的正常组织,进行RNA和蛋白质的提取,采用逆转录实时定量聚合酶链式反应(quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction, qRT-RCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(western blotting, WB)的方法对KIFC1的表达进行检测；再次,应用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)的方法,在组织微阵列芯片(tissue microarrays, TMA)中检测KIFC1的表达,并分析其与预后的关系。2. KIFC1在肺癌细胞系生长中扮演的角色及其作用机制的研究首先,我们从中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所选购状态良好的三株人的NSCLC细胞系,包括A549、H1299和SPC-A1,并在合适的培养条件进行培养；其次,从上海吉玛公司订购KIFC1的siRNA和空白对照的siRNA对三个细胞株分别进行干扰,用qRT-RCR和western blotting的方法检测干扰效率；再次,采用MTT、克隆形成以及流式细胞分析(flow-cytometric analysis, FCA)等技术对干扰后细胞系的生长速度、克隆形成能力以及细胞周期等进行分析；最后,通过比较转染KIFC1的siRNA和空白对照的siRNA对细胞系生长速度和周期的影响并结合相关文献报道,利用western blotting的方法对现象进行更进一步的分子机制的研究。结果1.原发性肺癌组织中KIFC1表达的检测以及与生存预后的关系1.1公共数据库中KIFC1在原发性肺癌组织中的表达情况Oncomine (www.oncomine.org)数据库中包括Garber、Hou、Selamat和Okayama在内的多个有关原发性肺癌的统计研究都显示,无论是小细胞肺癌还是非小细胞肺癌,在肺癌组织中KIFC1 mRNA的表达均明显高于配对的正常组织。1.2公共数据库中KIFC1的表达与肺癌预后的关系Kaplan-Meier plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)数据库中显示,高表达KIFC1的非小细胞肺癌患者较低表达KIFC1的患者拥有更短的无进展生存期(progress-free survival, PFS)以及更差的总生存期(overall survival, OS),且两者具有明显的统计学差异。当对腺癌和鳞癌进行亚组分析时,腺癌患者中仍可得到相同的结果；而在鳞癌患者中,与KIFC1高表达相比,低表达KIFC1的患者拥有较长的PFS,但在OS方面并没有显著的统计学差异。1.3临床标本中检测KIFC1的表达采用qRT-RCR的方法分析40例临床接受手术切除治疗的NSCLC患者癌组织及配对的正常组织的mRNA的表达,结果显示有28例患者癌组织中的KIFC1是过表达的,两者具有明显的统计学差异(P<0.001)。Western blotting分析也显示,蛋白质水平KIFC1在癌组织的表达也明显高于配对的正常组织。1.4组织芯片中KIFC1表达的检测为了更进一步验证KIFC1在肺癌组织较正常组织表达高,我们采取了多中心的研究方案。对上海芯超公司的肺癌微阵列组织芯片(TMA)进行免疫组化(IHC)的染色,结果发现在90例配对组织的患者中,有83例患者癌组织中KIFC1的表达高于其正常组织；癌组织中,若以免疫评分的平均值为截断点,则有65.6%(56/90)的患者为KIFC1的高表达。1.5 TMA中患者KIFC1的表达与生存之间的关系TMA中包含90例肺癌患者,白手术之日起开始随访,随访时间为5-10年。剔除8例非腺癌患者后,剩余的82例肺腺癌患者中有51例患者存在KIFC1的高表达,31例患者属于低表达,生存分析显示KIFC1高表达的患者拥有更短的OS,两组具有明显的统计学差异(P=0.04)。2. KIFC1王肺癌细胞系生长中扮演的角色及其作用机制的研究2.1 KIFC1 siRNA可以有效的沉默肺癌细胞系中KIFC1的表达我们选取三株常用的NSCLC细胞系：A549、H1299和SPC-A1,分别用KIFC1 siRNA和空白对照的siRNA对细胞系进行干扰,24小时后提取RNA进行qRT-RCR,48小时后提取蛋白质进行Western blotting;结果发现,无论在蛋白质水平还是在mRNA水平,与空白对照的siRNA处理组相比,经过不同的si-KIFC1-1和si-KIFC1-2干扰后明显降低了细胞株中KIFC1 mRNA的表达以及蛋白质的合成,说明订购的两条KIFC1的siRNA均可有效的敲降肺癌细胞系中KIFC1的表达。2.2敲降NSCLC细胞系中KIFC1的表达可以抑制细胞的增殖在人类NSCLC细胞系中检测敲降KIFC1后对细胞生长的影响。MTT实验中显示,与转染了阴性对照的siRNA组相比,si-KIFC1-1和si-KIFC1-2的转染明显减慢了A549、H1299以及SPC-A1细胞的增长；而平板克隆实验中同样得出KIFC1的敲降极大地阻碍了细胞系克隆形成的能力。因此,这些结果说明KIFC1的低表达可以抑制人NSCLC细胞系的增殖。2.3 KIFC1的消耗可以导致细胞周期阻滞在G2/M期由于KIFC1的表达可以影响细胞的增长,因此,我们采用流式细胞技术检测了KIFC1在肺癌细胞系A549和SPC-A1细胞周期进程中的调节作用。最终的实验结果显示敲除掉KIFC1后通过增加G2/M期细胞的比例,降低G0/G1期的细胞比例阻滞了A549和SPC-A1细胞的周期进程。这些结果表明KIFC1的低表达可以将细胞周期阻滞在G2/M期,也就是说KIFC1可能会通过调节细胞周期中G2/M期的进程参与肿瘤的发生发展。2.4敲降KIFC1可以上调p21的表达并抑制cdc2的活性相关文献报道cdc2在G2/M期的转化中起着重要的作用,故而,我们检测了小干扰RNA干扰后A549和SPC-A1细胞中cdc2的表达情况。与细胞周期的结果不谋而合,在A549和SPC-A1细胞中敲降KIFC1的表达后细胞周期蛋白cdc2的表达有所减少。我们同样检测了cdc2因子上游的几个靶分子蛋白,所得结果显示沉默掉KIFC1的表达后,与cdc2蛋白的变化趋势相反,两株细胞系中p21蛋白的表达均有所上调。结论我们的实验表明在肺癌组织中KIFC1是呈高表达状态的,而且其高表达状态与差的预后相关。进一步探索其机制显示在NSCLC细胞中KIFC1的下调可能会通过上调p21的表达抑制cdc2的活性,进而将细胞周期阻滞在G2/M期。这些都说明KIFC1可以作为诊断肺癌的生物标志之一,或者成为肺癌的一个独立预后因子,并为肺癌治疗的进一步研究提供了一定的理论基础。