“吻管水肿病”是方斑东风螺(Babylonia areolata)养殖中主要病害之一,主要症状为体表粘液增多,吻管水肿外露,不能缩回吻鞘,足部浮肿。该病传播速度快、死亡率高,在3-5d内死亡率可高达60-90％,可常年流行,特别是3.5月和10-12月发病最为严重,对东风螺养殖业危害较大。本文以方斑东风螺“吻管水肿病”为对象,对该病的病原菌分离鉴定、致病性和药敏试验、组织病理学、传播途径及致病菌的快速检测方法进行了系统研究,主要内容如下:　　 从患吻管水肿病的垂死方斑东风螺病灶处分离到一株优势菌,该菌对方斑东风螺有较强致病性,半致死浓度L,D50为6.31×105CFU/g。该菌为革兰氏阴性菌,在TSA平板上菌落呈圆形,在TCBS上菌落为黄色,能运动,经常规生理生化鉴定,符合哈维氏弧菌(Vibrio harveryi)典型特征,经Biolog~菌鉴定系统鉴定,该菌为哈维氏弧菌的可能性为99％,同时设计引物进行PCR扩增toxR基因,得到一个长度为382 bp的DNA片段,测序后Blast分析和哈维氏弧菌的该基因同源性高达100％；因此,该菌被鉴定为哈维氏弧菌,命名为哈维氏菌HL09。药敏试验表明,该致病菌对庆大霉素、卡那霉素、氟哌酸、恩诺沙星、复方新诺明和氟苯尼考等敏感,而对阿莫西林、安苄青霉素、青霉素G、多粘菌素B等有抗性。　　 取患病方斑东风螺各主要器官组织,制作常规石蜡切片,并进行苏木精伊红(H.E.)染色,分析组织的病理学变化。结果显示吻管、消化道、鳃和腹足等主要器官组织发生较严重病变。其中,吻管外表皮细胞部分脱落,肌肉层间出现空泡,内含大量的细菌。消化道壁肿大,黏膜层细胞微绒毛脱落,甚至消失,上皮细胞变形脱落,消化道中残留大量上皮细胞碎片和血细胞混合物。粘膜下层出现大量空泡,粘膜层有粒细胞浸润。鳃的病理变化为轻微感染的部位纤毛缩短,鳃丝间隔仍清晰可见,感染严重时鳃丝上皮变薄甚至脱落,脱离基膜,纤毛大量消失；鳃丝肿胀,鳃丝双层上皮细胞间距离增大,结缔组织细胞破裂形成空白区域,出现大量空泡,细胞间隔变大,结缔组织排列零散。鳃上皮细胞游离面极不规则,细胞之间界限不清晰等。鳃丝间时常可见游离的上皮细胞,支持组织和血管分支小管严重受损,无完整的形态,整体结构破坏程度大。鳃腔结缔组织间可见大量细菌感染,粒细胞增多；腹足主要病理变化为上皮细胞肿胀,与基膜脱离,并逐渐脱落,皮下的结缔组织代偿性增生,其中有大量的血窦,并有血细胞的浸润,肌纤维断裂,肌肉细胞间出现大量空泡,可见到大量细菌感染。其它内脏器官,如心、肝、肾等都出现了一些病理变化。　　 利用穿梭质粒pVSV102将绿色荧光蛋白转入到致病哈维氏菌HL09中,构建了一株能表达绿色荧光蛋白的哈维氏菌株HL09-GFP。经试验表明,绿色荧光质粒在哈维氏菌HL09中的表达对于该致病菌的菌落形态、生长速度和致病性都没有显著影响；健康的方斑东风螺用哈维氏菌HL09-GFP浸泡攻毒(5×107CFU/mL),攻毒后取各器官组织,经过福尔马林固定、20％蔗糖脱水处理后,制作成冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片。结果表明,10 h浸泡攻毒后鳃丝粘液和鳃表皮层、吻管粘膜上皮、腹足纤维结缔组织等均有哈维氏菌HL09-GF侵染,说明这些和外界水体接触的部位可能是致病菌感染东风螺的途径入口。24 h肾、心、消化道、消化腺也相继出现细菌感染情况,表明了细菌入侵后随血流在体内各组织间扩散分布。　　 方斑东风螺经腹足注射哈维氏菌HL09-GFP后,用实时定量PCR的方法检测细菌在螺体内的动力学,研究表明:在感染后1-12 h,腹足注射部位的细菌数量持续减少,到24 h,腹足细菌数量达到最低值,只有4.1×104CFU/g,而此时,消化道中细菌数量高,达到5.1×106CFU/g,其次是鳃和吻管,分别为6.4×105CFU/g和5.2×105CFU/g,说明致病菌在方斑东风螺体内有一定的组织特异性,消化道、吻管和鳃是细菌主要集聚的地方。注射感染后第48 h到72 h,各器官组织的细菌数量迅速增长,达到较高水平,呈现全身性感染症状。　　 为实现对海产贝类中哈维氏弧菌的快速检测鉴定,我们采用了环介导等温扩增技术(LAMP)来进行哈维氏弧菌的快速鉴定。我们设计四个引物,两外引物和两内引物来检测哈维氏弧菌的toxR基因序列,LAMP反应体系为25μL,反应条件为65℃反应60 min,接着反应在80℃终止5 min。结果显示该哈维氏弧菌LAMP检测方法与其它细菌种类之间无交叉反应,表明该LAMP检测方法特异性强。用哈维氏弧菌的纯培养液及与健康贝类组织匀浆混合物进行LAMP分析,发现其灵敏度达到了10-5稀释度(相当于每个反应17.2个细菌细胞水平),检测灵敏度比常规PCR反应高10倍。反应终止后向体系中加入1μLSYBR GreenⅠ,可肉眼观察阳性反应结果呈绿色,而阴性结果桔黄色。由此可知,本试验中建立的哈维氏弧菌LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高及检测快速等特点。