研究背景和研究目的当前男性不育发病率逐年升高,中国人口协会2013年调查显示夫妻不孕不育中,男性不育为主因的占35%。根据向桂桥等2005年统计资料,致不育的原因与儿童时期睾丸发育异常、睾丸损伤、免疫、内分泌、感染等因素密切相关,部分与遗传有关。因此,探明儿童睾丸生殖功能损伤及修复的可能机制,可以为后续促进生殖功能恢复的研究指明方向。众所周知,睾丸组织主要由3大类细胞组成:生精、间质和支持细胞。生精细胞的主要功能为精子生发,间质细胞能生产雄激素,而支持细胞则具有多种重要作用,甚至被称为生精细胞的“保姆细胞”。因其最早由意大利Enricol Sertoli于1865年发现,Sertoli细胞由此得名。近年来研究发现,睾丸支持细胞除对生殖细胞有支持和营养作用,同时还具有构成血睾屏障,参与自身免疫豁免(免疫相关),形成睾丸内环境,产生类固醇类物质(内分泌相关),吞噬细胞残体等重要功能;此外,支持细胞上的雄激素受体(androgen receptor AR)也被认为与男性不育症密切相关,AR基因先天突变即可引发。鉴于睾丸支持细胞的重要性,以及希望实验研究的集中性,我们选取了睾丸支持细胞作为本次生殖相关实验的观察对象。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)2000年首次在小片段人胎脑cDNA文库中被提取出来,但其作用直到近年才为人所关注,常见于多种恶性肿瘤细胞中,被认为可以通过稳定c-myc促进细胞增殖和锚定独立生长、阻滞凋亡和分化来促进体内恶性肿瘤的发生和发展。目前关于CIP2A的研究绝大部分集中于肿瘤。我们将之引入睾丸生殖功能研究的原因在于:(1)Junttila MR等2007年在Cell杂志上指出:人类与鼠类两种动物的所有类型的组织器官中,睾丸组织中的CIP2A含量最高。(2)2012年Sami Ventela等发现在CIP2A基因敲除的小鼠睾丸组织中,有自我更新能力的PLZF随之下降,其他相关基因包括OCT4、Nanog等的表达也在mRNA水平减少,同时出现精子生成不足,从而得出CIP2A有促进生精功能的推测。(3)目前CIP2A在睾丸中作用的相关研究极为罕见,以CIP2A和testes/testis为关键词在Pubmed、Springer等知名文献搜索引擎上仅能命中1篇(即上文提及的Sami Ventela等的研究),国内未见,故CIP2A在睾丸组织中是否能促进生精功能尚待进一步确证;而鉴于支持细胞在男性生殖中的重要作用,我们也希望能初步了解CIP2A对支持细胞及雄激素受体是否存在影响及可能机制,这也是我们设立本实验的初衷。综合上述,我们推测CIP2A可能在睾丸的生殖功能中扮演较为重要的角色,因此拟用小鼠Sertoli细胞实验来进一步明确其可能作用。研究内容1、明确CIP2A及FasL蛋白在Sertoli细胞中的分布情况并定位,了解其mRNA表达水平。2、设计并制作CIP2A siRNA,转染Sertoli细胞并验证。3、明确CIP2A调降后对睾丸支持细胞的增殖、凋亡以及雄激素受体的影响,探讨可能机制,帮助了解CIP2A在睾丸支持细胞中的作用及其对生精功能的影响。研究方法1.本论文是以小鼠Sertoli细胞(TM4细胞系FasL阳性,购自上海生物细胞库)为细胞模型,CIP2A siRNA质粒和空白对照慢病毒质粒(Control siRNA)为分组研究工具,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-Actin抗体等为标准化内参行相关细胞增殖、凋亡及AR方面的研究。2.IF检测正常Sertoli细胞中CIP2A蛋白和FasL蛋白分布:按照实验需要将细胞种于盖玻片上培养及处理,再进行免疫荧光实验处理,最后应用激光共聚焦显微镜观察并记录。3.RT-PCR 行 CIP2A mRNA 及雄激素受体(Androgen Receptor AR)mRNA 定量检测:应用氯仿从细胞系中提取总RNA,检测总RNA纯度和完整性,根据反转录试剂盒说明反转录成cDNA,按照BestarTM试剂盒说明进行定量PCR扩增检测。数据由ABI 7500系统软件SDS自动生成,以PCR循环数对Rn作扩增曲线来确定Ct值(即到达阈值所需的循环数)。目的基因相对表达量以18sRNA校正后按以下公式计算:2-Ct[Ct=Ct(目的基因)-Ct(18sRNA)]。4.构建CIP2A siRNA并转染靶细胞,western blot法和定量PCR法检测睾丸支持细胞内的CIP2A蛋白及CIP2AmRNA表达情况,确认是否可有效沉默CIP2A基因表达。5.转染细胞经96孔板行单克隆培养,待其逐渐增大后应用定量PCR法测定转染细胞中AR mRNA表达情况。另外采用免疫荧光实验手段(同“2”中描述)测定FasL在转染细胞中的表达情况。6.在转染细胞中应用噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测凋亡情况。研究结果1.成功构建CIP2A siRNA,并证实转染小鼠正常Sertoli细胞后有显著降低CIP2A基因mRNA水平表达及蛋白合成的效果。2.应用工F检测发现CIP2A与FasL均在小鼠正常Sertoli细胞中大量分布,其中CIP2A蛋白主要出现在胞浆中,FasL蛋白则主要出现在细胞核内。当CIP2A敲低后,FasL DNA与蛋白荧光显影强度显著降低。3.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内在参照物,发现小鼠正常Sertoli细胞中CIP2A与AR在mRNA水平表达上均较显著。当CIP2A敲低后,两者在mRNA水平均出现下降。4.MTT法检测每组细胞增殖情况。实验结果显示,CIP2A siRNA感染72h后,可显著抑制细胞增殖。5.流式细胞术检测CIP2A敲低对细胞周期及细胞凋亡的影响,结果示CIP2A siRNA感染72h后,可导致细胞凋亡的发生。结论1.CIP2A siRNA可有效敲低细胞中CIP2A的mRNA表达水平及蛋白合成。2.FasL可能受CIP2A调控。FAS/FASL系统不直接参与支持细胞自发性凋亡的调控。3.CIP2A敲低可导致小鼠Sertoli细胞的增殖能力受损,结合前述其可导致细胞凋亡,说明CIP2A有促进Sertoli细胞发育,减少细胞凋亡的重要作用。4.CIP2A敲低时后可引起AR表达显著下降,可能进一步影响雄激素蛋白的分泌。说明CIP2A有维持Sertoli细胞内分泌功能的重要作用。