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第一部分大鼠脑出血后脑组织中LRRK2蛋白的表达变化目的探讨大鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后脑组织中 Leucine-rich repeat kinase 2(LRRK2)蛋白的表达变化。方法1.实验动物分组:选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300g),随机分为正常组、假手术组、ICH后各时间点组(3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、7天)。2.活体ICH组模型建立及标本提取:通过立体定向仪将穿刺取出的心脏动脉血注入右侧基底节区。假手术组大鼠,仅行颅骨钻孔及心脏穿刺抽血,未注血。而后在脑出血后各时间点处死大鼠并灌注取脑。3.利用蛋白印迹法(Western-blot,WB)观察大鼠ICH后脑组织中不同时间点的LRRK2蛋白水平改变。免疫荧光共染分析大鼠ICH后LRRK2蛋白的表达定位及变化。结果1.假手术组与正常组相比,LRRK2蛋白表达未见明显变化。与假手术组相比,ICH后LRRK2蛋白表达增高,ICH后6小时为表达高峰(P<0.01),6小时后急剧下降,然后逐渐升高但均低于ICH后6小时水平。2.假手术组中LRRK2蛋白在血肿周围脑组织神经元中的表达较正常组未见明显变化,而在ICH 6小时组脑组织神经元中LRRK2蛋白的表达较假手术组明显上升。结论LRRK2在脑出血后脑组织神经元中的表达水平显著增加。第二部分 LRRK2在大鼠脑出血后继发性脑损伤中的作用研究目的研究LRRK2在大鼠脑出血后继发性脑损伤中的作用。方法1.实验动物分组:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300g),被随机分为假手术组、ICH 组、ICH+vehicle 组、ICH+GNE-7915 组、ICH+Si-NC 组、ICH+Si-LRRK2组、ICH+Vector 组、ICH+Over-LRRK2 共 8 组,每组 12 只。2.活体ICH组模型建立:同第一部分。3.给药方法:在ICH+GNE-7915组中,LRRK2抑制剂GNE-7915溶于DMSO至88mg/ml,然后在ICH建模前6小时以25 mg/kg的剂量进行腹腔内注射,vehicle组在ICH建模前6小时腹腔注射与干预组等量的相应溶剂。LRRK2-siRNA或control siRNA以500 pmol/10μl的浓度溶于去离子水中,然后500 pmol LRRK2-siRNA或control-siRNA再溶于10μl的体内转染试剂中,然后在ICH建模前24h将LRRK2-siRNA 或 control siRNA 注入大鼠侧脑室。Over-LRRK2 质粒和 vector-LRRK2则是稀释成0.5 mg/ml的浓度,在ICH建模前24h注入大鼠侧脑室。4.各组大鼠在建模6小时后行行为学评分,抽取股动脉血分离血清,然后一部分大鼠(每组6只)直接取脑,采用干/湿比重法检测脑水肿变化情况;另一部分灌注取脑,留取大鼠血肿周围脑组织做标本。采用FLUORO-JADE B荧光染色法和Nissl染色法分析大鼠脑组织神经元细胞退化情况;TUNEL与神经元共染观察大鼠大脑皮层神经元的凋亡;ELISA、ROS、LDH检测大鼠ICH后炎性指标变化;蛋白质印迹(Western-blot)法分析脑组织中Albumin蛋白的表达变化评估血脑屏障破坏情况。结果1.与假手术组相比,ICH组大鼠的神经行为学评分显著上升(p<0.01);ICH+GNE-7915组大鼠的神经行为学评分较ICH+vehicle组下降明显(p<0.05);ICH+Si-LRRK2组大鼠的神经行为学评分明显低于ICH+Si-NC组(p<0.05);ICH+Over-LRRK2组大鼠的神经行为学评分明显高于ICH+Vector组(p<0.05);而ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector组大鼠神经行为学评分较ICH未见明显变化。2.大鼠ICH组血肿侧基底节区和皮层脑组织水肿较假手术组明显加重(p<0.01),而与ICH组相比,ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector组血肿侧基底节区和皮层脑组织水肿未见明显改变;ICH+GNE-7915组血肿侧基底节区和皮层脑组织水肿明显低于ICH+vehicle组;ICH+Si-LRRK2组较ICH+Si-NC组血肿侧基底节区和皮层脑组织水肿显著下降(p<0.01);ICH+Over-LRRK2组比ICH+Vector组血肿侧基底节区和皮层脑组织水肿明显加重(p<0.01)。而在各组中,血肿对侧基底节区和皮层脑组织、小脑水肿均未见明显差异。2.与假手术组相比,大鼠ICH组FJB阳性细胞显著增多(p<0.01);而与ICH组相比,ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector 组 FJB 阳性细胞未见明显变化;ICH+GNE-7915 组 FJB 阳性细胞明显少于 ICH+vehicle 组;ICH+Si-LRRK2 组较 ICH+Si-NC组FJB阳性细胞显著减少(p<0.01);ICH+Over-LRRK2组比ICH+Vector组FJB阳性细胞明显增加(p<0.01)。与假手术组相比,大鼠海马CA1区和皮层的存活神经元明显减少(p<0.01);而与ICH组相比,ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector组存活神经元未见明显改变;ICH+GNE-7915组存活神经元明显多于ICH+vehicle组;ICH+Si-LRRK2组较ICH+Si-NC 组存活神经元显著增多(p<0.01);ICH+Over-LRRK2 组比 ICH+Vector组存活神经元明显下降(p<0.01)。3.大鼠ICH组较假手术组TUNEL 阳性神经元明显增多(p<0.01);而与ICH组相比,ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector组TUNEL 阳性神经元均未见明显改变;ICH+GNE-7915 组 TUNEL 阳性神经元明显少于 ICH+vehicle 组;ICH+Si-LRRK2组较ICH+Si-NC组TUNEL 阳性神经元显著减少(p<0.01);而ICH+Over-LRRK2组比ICH+Vector组TUNEL 阳性神经元明显变多(p<0.01)。4.与假手术组相比,大鼠ICH组ROS、LDH、TNF-α、IL-1β水平明显增高(p<0.01),而与 ICH 组相比,ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector 组 ROS、LDH、TNF-α、IL-1β水平变化不大;ICH+GNE-7915组ROS、LDH、TNF-α、IL-1β水平明显低于ICH+vehicle 组;ICH+Si-LRRK2 组较 ICH+Si-NC 组 ROS、LDH、TNF-α、IL-1β 水平显著下降(p<0.01);ICH+Over-LRRK2 组比 ICH+Vector 组 ROS、LDH、TNF-α、IL-1β水平明显升高(p<0.01)。5.与假手术组相比,ICH组大鼠脑组织的Albumin蛋白表达显著增加(p<0.01);而 ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector 组较 ICH 组未见明显变化;ICH+GNE-7915组 Albumin 蛋白表达较 ICH+vehicle 组明显下降(p<0.01);ICH+Si-LRRK2 组 Albumin蛋白表达明显低于ICH+Si-NC组(p<0.01);而ICH+Over-LRRK2组Albumin蛋白表达明显高于ICH+Vector组(p<0.01)。结论抑制LRRK2可以降低大鼠脑出血后神经元的凋亡和退化,减少炎症,改善神经行为学能力,减轻脑水肿和血脑屏障破坏,进而减轻继发性脑损伤;反之,激活LRRK2则会增加神经元的凋亡和退化,加重炎症、神经行为学损害、脑水肿及血脑屏障破坏,进而促进继发性脑损伤。提示LRRK2在大鼠脑出血后继发性脑损伤中发挥重要作用,其可能作用机制是通过调控细胞凋亡或炎症反应作用。第三部分LRRK2通过调控p38MAPK/Drosha通路参与大鼠脑出血后继发性脑损伤的作用机制研究目的研究LRRK2通过调控p38MAPK/Drosha通路在大鼠脑出血后继发性脑损伤中的作用机制。方法1.实验动物分组:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250-300 g),被随机分为假手术组、ICH 组、ICH+vehicle 组、ICH+GNE-7915 组、ICH+Si-NC 组、ICH+Si-LRRK2组、ICH+Vector 组、ICH+Over-LRRK2 共 8 组,每组 6 只。2.活体ICH组模型建立及标本提取:同第一部分。3.给药方法:在ICH+GNE-7915组中,LRRK2抑制剂GNE-7915溶于DMSO至88mg/ml,然后在ICH造模前6小时以25 mg/kg的剂量进行腹腔内注射,vehicle组在ICH造模前6小时腹腔注射与干预组等量的相应溶剂。LRRK2-siRNA或control siRNA以500pmol/10μl的浓度溶于去离子水中,然后500pmol LRRK2-siRNA或control-siRNA再溶10μl的体内转染试剂中,然后在ICH模型建立前24h将LRRK2-siRNA 或 control siRNA 注入大鼠侧脑室。Over-LRRK2 质粒和 vector-LRRK2则是稀释成0.5 mg/ml的浓度,在ICH模型建立前24h注入大鼠侧脑室。4.体内实验检测指标:采用蛋白质印迹(Western-blot)法分析脑组织中LRRK2蛋白、p38 MAPK蛋白及其磷酸化、Drosha蛋白及其磷酸化的表达变化。5.体外ICH模型:利用原代大鼠大脑皮层神经元细胞建立ICH体外模型,并行利用氧合血红蛋白(OxyHb)干预处理。分为正常对照组、OxyHb组、OxyHb+vehicle组、OxyHb+GNE-7915组,每个实验均进行三次独立重复。OxyHb组:在体外神经元细胞培养基中添加OxyHb处理6小时。OxyHb+vehicle组:在体外神经元细胞培养基中添加DMSO(与GNE-7915溶剂等剂量)预处理1小时,然后添加OxyHb处理6小时。OxyHb+GNE-7915组:在体外神经元细胞培养基中添加GNE-7915预处理1小时,然后添加OxyHb处理6小时。6.体外实验检测指标:运用Western Blot检测LRRK2蛋白、p38 MAPK蛋白及其磷酸化、Drosha蛋白及其磷酸化的表达变化;Hoechst染色和细胞流式法(PI and Annexin V染色)检测细胞凋亡情况。结果1.在体内:与假手术组相比,ICH组大鼠脑组织的LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平显著增加(p<0.01):而ICH+vehicle、ICH+Si-NC、ICH+Vector组较ICH组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平未见明显变化;ICH+GNE-7915组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平较ICH+vehicle组明显下降(p<0.01);ICH+Si-LRRK2组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平明显低于ICH+Si-NC组(p<0.01);而ICH+Over-LRRK2组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平明显高于 ICH+Vector 组(p<0.01)。2.在体外:OxyHb组较正常组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平显著增加(p<0.01),OxyHb+vehicle组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平较ICH组未见明明显变化,而OxyHb+GNE-7915组LRRK2蛋白表达、p38 MAPK蛋白和Drosha蛋白磷酸化水平明显低于OxyHb+vehicle 组(p<0.01)。3.在体外:OxyHb组较正常组细胞凋亡明显增加,OxyHb+vehicle组细胞凋亡较OxyHb组未见明显变化,而OxyHb+GNE-7915组比OxyHb+vehicle组细胞凋亡明显下降。结论LRRK2可通过调控p38MAPK/Drosha通路在大鼠脑出血后继发性脑损伤发挥重要作用,抑制LRRK2可抑制p38MAPK/Drosha通路,减轻脑出血后神经元凋亡,进而在脑出血后继发性脑损伤中起保护作用。