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壳聚糖是自然界广泛存在的天然阳离子多糖,生物相容性和生物降解性能好、安全无毒,作为非病毒基因载体具有潜在的应用价值。但壳聚糖溶解性差、靶向性弱和转染率低等缺点限制了其应用。本文通过烷基化反应,将烷基长链接到壳聚糖主链上,再通过季铵化反应,改善其亲水性,合成出一种新型的壳聚糖基非病毒基因载体-N,N,N-三甲基-N-辛基壳聚糖。
红外分析和核磁共振谱图分析表明,成功合成了目标产物,元素分析结果表明,所制得的三组N,N,N-三甲基-N-辛基壳聚糖(TM-ACS)烷基侧链的取代度随着辛醛投料量的增加而变大,核磁共振分析结果发现,三组产物的季铵化取代度逐渐减小。溶解性实验结果表明,三组产物的溶解性比原料壳聚糖明显改善,能很好的溶解在1%醋酸溶液和水中,甚至在pH=7.4的PBS缓冲溶液中也具有良好的溶解性。
以芘为荧光探针,利用稳态荧光法,测定了不同浓度下,TM-ACS增溶芘后的荧光光谱,研究TM-ACS在水中的聚集行为,通过绘制I373/I384-浓度的曲线,得出TM-ACS在水中临界胶束浓度。
采用复凝法,制备了不同N/P的TM-ACS-1/EGFP-DNA复合物,琼脂糖凝胶电泳研究表明,N/P=1时,该壳聚糖衍生物就可以完全阻滞DNA的迁移;复合物的粒径随着N/P的增大而逐渐减小,并稳定在180nm左右,Zeta电势随着N/P的增大而增大;MTT检测发现复合物对Chang liver肝实质细胞的细胞毒性较小,进一步细胞毒性试验表明,TM-ACS-1材料本身对A549细胞毒性明显小于PEI-25KDa;体外转染试验发现,N/P=5时,在荧光倒置显微镜下就能观察到细胞内绿色荧光蛋白的大量表达,这说明DNA已经成功的转运到细胞内部并表达。