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土壤盐碱化已是一个全球性生态问题,对农业生产带来了极其不利的影响。在我国很多地区,土壤盐碱化已成为限制植物生长和发育以及造成农作物减产的主要原因。大豆作为传统的可食用的豆科作物,属于少数可以固氮的植物。由于本身的固氮效应,较绝大多数作物而言可以及其显著地减少氮肥使用,进而对改善土壤和大气环境产生极其重要的作用。所以对大豆耐盐性的探究可以进一步提高其适应盐渍环境的能力。大豆耐盐性是由多基因控制的复杂性状。大豆在逆境环境中,会受到多种胁迫的影响,如离子胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等,其中离子胁迫是大豆遭受的一个非常重要胁迫因素。目前,大豆耐盐性发生机理的研究主要集中在重建细胞离子平衡、维持渗透平衡、修复氧化平衡和其它代谢或结构的适应性调节等多个方面。通过对植物耐盐基因(如SOS1和NHX1)的挖掘,可使其相应的转基因植物耐盐性得到提高,但目前还没有获得耐盐性明显提高,稳产和丰产性都很好的转基因耐盐品种。因此,要实现大豆耐盐性状的改良,必须对大豆耐盐胁迫的分子机理有较为深入的研究。通过探索大豆耐盐机理,提高大豆耐逆性,较好的利用并改善逆境环境(如盐碱地)将是提高大豆产量的一个重要途径。大豆在逆境环境中,会受到多种胁迫的影响,如离子胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等,其中离子胁迫是大豆遭受的一个非常重要胁迫因素。本研究以栽培大豆(G max)N23674品种和野生大豆(G soja)BB52品系为研究对象,以GmCLC1基因所编码的氨基酸序列为基础,通过保守结构域分析和同源比对的方法,从公共网络数据库NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Pfam数据库(https://pfam.xfam.org/)搜寻大豆GmCLCs家族基因,对大豆GmCLCs家族基因进行了完整的克隆。在此基础上,并利用Clustalx、Genedoc、MEGA6.0和MapInspect等相关生物信息学软件,对大豆GmCLCs家族基因进行生物信息学分析。结果显示:大豆氯离子通道家族共有8个拷贝,别分布于第1、5、9、11、13、16和19号染色体上,含有的内含子数目为4至23个,编码氨基酸的数量为725至823个,整体的相似度为63.43%,理论的等电点范围为6.45至8.94,带正或负电荷氨基酸残基比例为7%-10%,均为跨膜蛋白(含9-12个跨膜区),且它们都与拟南芥CLC蛋白亚家族I关系较近。利用发根农杆菌K599注射侵染栽培大豆子叶或子叶下胚轴,诱导出转GmCLCs基因家族各成员的大豆发根组合植株幼苗。在120 mM NaCl胁迫下15 d后,检测大豆发根和叶片的相对电解质渗漏率,叶绿素含量以及枯萎率。分析和比较大豆氯离子通道家族各成员基因对NaCl胁迫的响应。结果表明:在120 mMNaCl胁迫下,在大豆根部过表达GmCLC-b1或G/mCLC-c2基因后,大豆植株的生长表型较对照组有显著地改善,植株的相对电解质渗漏率、叶绿素含量以及枯萎率,都达到显著性差异。而在大豆根部过表达GmCLC-d1基因后,大豆植株幼苗较对照组,其生长表型变得更差。其植株的相对电解质渗漏率和枯萎率都显著升高叶绿素含量都显著下降。而过表达其它GmCLCs基因成员都对大豆植株的生长表型有所改善,但都没有GmCLC-b1或GmCLC-c2基因显著。通过荧光定量PCR技术,对GmCLCs基因在150mMNaCl胁迫下,大豆根、茎、叶中的表达量的变化及其对盐胁迫响应的功能机制进行了较为深入的研究。qRT-PCR结果分析表明:在150mmol·L-1NaCl处理24 h过程中,GmCLCs基因整体上都呈现先下降后上升的表达趋势,其中在根和茎中GmCLC-b1,GmCLC-b2,GmCLC1,GmCLC-c1和CGmCLC-c2对NaCl的响应更加显著,而在叶中只有GmCLC-b1,GmCLC-b2,GmCLC1基因上调的更加显著。此外,将大豆GmCLCs基因导入氯离子通道基因(GEF1)缺失的酵母突变体中,发现GEF1基因的功能得到了很好的互补,且使其在NaCl和KCl胁迫下的生长得到了部分的恢复。这不仅表明了大豆GmCLCs基因对NaCl胁迫有着明显的响应,而且也暗示了氯离子通道基因对调控Cl-在酵母体内转运有着重要的影响。在前期功能验证及筛选的基础上,着重研究了大豆GmCLCs基因家族GmCLC1和GmCLC-c2成员对盐胁迫的明显缓解作用及其分子机理。在拟南芥和大豆发根组合植株中过表达GmCLC1后,发现盐胁迫下,大豆GmCLC1基因通过减少了 Cl-在拟南芥幼苗和大豆组合植株幼苗地上部的积累缓解了盐胁迫对幼苗生长的不利影响。将GmCLC-c2在拟南芥中过表达和回补,发现在盐胁迫下,CGmCLC-c2通过调控C1-和NO3-在幼苗体内的分布及含量,如降低拟南芥幼苗体内的Cl-/NO3-比值,进而间接地影响幼苗体内Na+和K+含量,从而使幼苗表现出对盐胁迫的缓解作用。此外,非洲爪蟾卵母细胞建立异源表达体系,将大豆GmCLC-b1和GmCLC-c2编码蛋白在非洲卵母细胞中进行异源表达,通过电生理实验对大豆GmCLC-b1和GmCLC-c2离子通道活性进行了检验。比较添加阴离子通道抑制剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)前后爪蟾卵母细胞上的电流变化,发现在加入NPPB前,检测电流随着电压的增加,较阴性对照呈几何倍数增加,而加入NPPB后,上述检测电流显著降低,与阴性对照组几乎没有差别。这显示了 GmCLC-b1和GmCLC-c2编码蛋白氯离子通道的属性。综上所述,通过大豆发根组合植株技术,荧光定量PCR技术和酵母突变体互补技术筛选出了积极参与大豆耐(氯)盐性调控的GmCLC1和GmCLC-c2基因成员,并利用拟南芥过表达与突变体回补技术和电生理技术,进一步揭示它们主要通过降低幼苗地上部Cl-含量和Cl-/N03-比值,参与大豆对盐逆境的适应过程。