研究背景:结肠直肠癌(CRC)是全球最常见的消化道恶性肿瘤。尽管近年来结直肠癌的化疗方式取得了长足的进步,包括以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的改进组合化疗手段,如5-FU和奥沙利铂或伊立替康的组合,但患者的五年存活率仍然不理想。此外,由于目前结直肠癌的诊断晚,患者被发现通常已处于癌症晚期,致使患者的生存预后差。因此,研究结直肠癌的分子机制,筛选有效的早期结直肠癌分子标志物,为结直肠癌患者的早诊早治提供理论基础,进一步达到提高患者生存率,改善患者的生存质量这一长远目标提供新的策略。据报道,Hippo信号通路在多种癌症的生物过程和肿瘤发生中失调。在哺乳动物中,Hippo途径由核心激酶盒构成,包括MST1/2激酶和LATS1/2激酶,以及衔接子SAV1和MOB1。Hippo信号通路通过泛素化-磷酸化机制调控将YAP和TAZ维持在较低活性水平。当Hippo信号通路失活,YAP1/TAZ能进入细胞核诱导TEA结构域(TEAD)家族成员(TEAD1-TEAD4)的转录激活,从而转录上调多个下游效应因子,最终在肿瘤原位的发生发展以及远处转移中发挥多种功效。此外,越来越多的研究表明,在各种类型的癌症中,Hippo信号通路的失活使癌细胞对化疗药物具有抗性。Chen等报道了上调miR-183c能同时下调MST1,LATS2,MOB1和SAV1促进胰腺癌的化疗耐药。此外,Touil及其团队的研究表明,YAP的过度活化促进了结肠癌细胞对5-FU的抵抗。因此,Hippo信号通路的失活被认为是癌症化疗抗性的关键介质。多种证据还表明,Hippo信号通路的失活会介导结直肠癌的发生发展。例如,REGγ直接靶向下调LATS1导致Hippo信号传导的失活,进而促进结直肠癌细胞增殖。另外,SCC-S2过表达通过抑制Hippo信号通路促进结直肠癌的侵袭和转移。可见,Hippo信号通路的失活在结直肠癌的进展中也起着至关重要的作用。更好地了解Hippo信号通路失活的潜在机制可能为开发更有效的癌症治疗方法提供新的思路。肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞中的少数群体,其特征在于具有自我更新、无限增殖和分化成多种癌细胞谱系的能力。肿瘤干细胞已被证实是导致化疗失败的重要原因之一,同时导致结直肠癌患者的不良预后。事实上,多个研究表明,肿瘤干细胞在多种人类癌症的诱导和维持化疗耐药中起着至关重要的作用。因此,有望通过研究维持CSCs特性的机制,为消除CSCs群体来提高结直肠癌患者化疗的疗效提供理论依据。激活蛋白2(AP-2)是DNA结合转录因子,在不同物种中高度保守,AP-2在哺乳动物中已鉴定出5个成员,其中包括AP-2α-?。AP-2蛋白在胚胎发育中起重要作用,有趣的是,大多数成熟组织中几乎检测不到AP-2蛋白表达;然而,在多种人类癌症中却观察到AP-2蛋白的表达丰度升高。例如,TFAP2A在鼻咽癌中表达升高,且TFAP2A通过诱导环氧合酶-2表达促进鼻咽癌的增殖和生长。此外,据报道TFAP2B在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞系中过表达,且TFAP2B对应的siRNA能在体外和体内一致地抑制非小细胞肺癌细胞的增殖以及诱导非小细胞肺癌细胞凋亡;而上调TFAP2B产生相反的效果。此外,越来越多的文献表明,AP-2蛋白在癌症耐药中起着至关重要的作用。TFAP2A在乳腺癌组织和细胞系中升高,且在对他莫昔芬耐药的肿瘤组织和细胞系中表达更高。TFAP2C在乳腺癌中的高表达导致激素抵抗,这与乳腺癌患者的不良生存率正相关。另外,由于高甲基化导致的TFAP2E低表达与结直肠癌化疗无应答显着相关。因此,这些研究表明,AP-2蛋白的不同成员对癌症化疗耐药中发挥着增强或抑制作用,这与微环境及肿瘤类型相关。ZNF280A最早鉴定于套细胞淋巴瘤的综合高分辨率全基因组分析,其携带有两个连续的Cys2His2型锌指结构域,是锌指蛋白家族的成员之一。该Cys2His2型锌指结构域是迄今为止最具特色的锌指类,在哺乳动物转录因子中极为常见。尽管这一类的锌指蛋白可以通过与DNA或RNA结合以及介导蛋白与蛋白之间的相互作用来发挥多种生物学功能,但是其最为人所知的功能,是通过典型的两个甚至更多的锌指结构重复串联,以DNA特异性序列与蛋白结合的方式,占据目标DNA结构的主要沟槽。许多研究已证明,锌指蛋白的不同成员,如ZNF746,PISA和SNAIL1,参与结直肠癌的发生、发展、转移。这些结果表明,锌指蛋白在结直肠癌中发挥着重要作用。与这些已报道的锌指蛋白成员相比,关于ZNF280A在癌症中的生物学功能和作用的报道很少。第一部分:TFAP2C通过抑制Hippo信号通路促进结直肠癌干性和化疗耐药研究方法:本研究通过实时荧光定量PCR,免疫印迹和免疫组化(IHC)方法评估临床结直肠癌组织中TFAP2C的表达,并利用统计学方法分析TFAP2C表达与结直肠癌患者临床病理特征、总体生存率和无进展生存率之间的相关性;通过体外和体内实验评估TFAP2C在结直肠癌细胞中的生物学功能;此外,利用免疫印迹,荧光素酶实验和染色质免疫共沉淀(ChIP)分析介导TFAP2C参与结直肠癌的生物学功能的信号途径。研究结果:本研究发现TFAP2C在结直肠癌组织和细胞中显著高表达,并且TFAP2C的高表达与结直肠癌患者的高分期临床病理特征、不良预后和疾病进展相关。此外,体外上调TFAP2C的表达可增强大肠癌细胞的成球能力,侧群细胞比例,干细胞因子表达和线粒体膜电位,并减少5-氟尿嘧啶诱导的结直肠癌细胞凋亡;体内上调TFAP2C可促进结直肠癌细胞的干性和化学耐药性;同时,沉默TFAP2C则会产生相反的效果。重要的是,下调TFAP2C可在体内显着增强结直肠癌细胞对5-FU的化学治疗敏感性。我们的结果进一步证明,TFAP2C是通过转录上调结直肠癌细胞中的ROCK1和ROCK2抑来制Hippo信号传导,从而促进结直肠癌细胞对5-FU的干性和化疗耐受。研究结论:(1)TFAP2C通过失活Hippo信号通路促进结直肠癌干性和化疗耐受。(2)TFAP2C是结直肠癌的新预后标志物,并且有望作为结直肠癌的治疗靶点,沉默TFAP2C与5-FU联合使用有望作为提高结直肠癌患者生存率的有效治疗策略。第二部分:ZNF280A通过失活Hippo信号通路促进结直肠癌细胞增殖和肿瘤发生研究方法:本研究通过检测结直肠癌临床样本组织中ZNF280A的表达,并利用体外细胞功能实验和体内动物实验研究ZNF280A对结直肠癌细胞增殖和肿瘤发生的作用。进一步利用免疫印迹和荧光素酶报告实验等分析介导ZNF280A参与结直肠癌的生物学功能的分子机制。研究结果:本研究发现,相对于癌旁组织和结直肠正常细胞,ZNF280A在结直肠癌组织和细胞系中表达上调明显,并且ZNF280A的高表达与TNM(肿瘤体积,淋巴结受累和远处转移)分类、临床分期有关,可用于预测结直肠癌患者的不良预后和疾病进展。此外,体外试验中沉默ZNF280A可抑制结直肠癌细胞的增殖并诱导G0和/或G1阻滞,而在体内实验中,沉默ZNF280A可明显抑制小鼠动物模型的肿瘤发生。在进一步的分子机制研究中,我们的结果证明,沉默ZNF280A可通过激活Hippo信号传导抑制结直肠癌细胞的增殖。研究结论:(1)ZNF280A通过失活Hippo信号通路促进细胞增殖和肿瘤发生。(2)ZNF280A是结直肠癌的新预后因素,并且有望作为结直肠癌的治疗靶点。